丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是一种具有包膜的单链正义RNA病毒。持续性HCV感染能够引发肝炎、肝硬化和肝细胞癌，严重威胁着人类健康。目前在丙型肝炎的预防和治疗中存在着一些问题，如抗HCV疫苗的研究尚未获得突破进展;耐药问题严重，急需新型的抗HCV药物。由于缺少稳定可靠的HCV感染细胞模型和动物模型，人们对HCV致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗等方面的研究进程受到严重阻碍。因此，开发新型HCV小动物模型，成为HCV研究中亟待解决的一个问题。　　 HCV蛋白的翻译机制不同于普通的真核生物翻译，是由其基因组5端非编码区的内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)介导的。IRES具有保守的二级结构，能够募集核糖体40S小亚基与病毒基因组RNA的结合，进而形成翻译起始复合物，行使启动蛋白翻译的功能;HCV Core蛋白作为病毒的核衣壳结构蛋白，在病毒的致病性方面具有重要作用，如导致肝细胞内脂代谢紊乱、参与肝细胞内氧自由基的产生和细胞凋亡，引发脂肪变性、肝纤维化及肝细胞癌;HCV非结构蛋白NS5A能够影响细胞内多种信号传导途径，如抑制ERK MAPK途径、抑制EGF激活的p38 MAPK途径及激活JNK信号途径等，并与凋亡调控因子如TNF-a、P53等相互作用，从而抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生。该蛋白能够与Core结合，并共同定位于细胞内的内质网和脂滴，影响细胞内脂肪酸的稳态，并共同诱导肝细胞氧化应激，因此，二者在HCV导致的病理过程中，可能存在一定的相互作用。　　 斑马鱼属脊椎动物，其生长发育过程、组织系统结构与人有很高的相似性，在基因和蛋白质的结构和功能上也具有较高的保守性，且具有养殖成本低、便于操作、繁殖能力强等优点，成为研究人类疾病发生机理的理想模式动物。由于斑马鱼肝脏的发育与人肝发育具有较大的一致性，本研究运用基因工程技术和转基因手段，建立了基于HCV IRES介导结构蛋白Core翻译的斑马鱼模型，并用以评价药物在体内的IRES抑制活性;建立了一种肝特异表达的HCV NS5A表达模型，研究NS5A对于肝脏病变的作用;另外，将二者共注射，探索了Core和NS5A共同表达的斑马鱼模型，以求对NS5A和Core在肝脏病理层面的相互作用进行探讨。　　 HCV IRES介导结构蛋白Core翻译的斑马鱼模型的建立:利用斑马鱼脂肪酸结合蛋白增强子与人肝脂酶启动子序列构建了共同调控报告基因EGFP与HCVIRES-core序列的双顺反子基因表达构件pFL-GIC。在此基因构件中，gfp与core能够转录于同条mRNA链，但二者在翻译水平是独立的，GFP蛋白的合成由通常的“帽子”结构介导，而Core蛋白的合成是由IRES介导的。注射此基因构件的斑马鱼幼体在荧光显微镜下可观察到EGFP荧光在肝脏区域的表达。通过RT-PCR与Western-bloting的方法，证实core与gfp的表达均可随斑马鱼幼体的发育时间而增强。HCV Core的表达使得斑马鱼幼体中与肝细胞脂肪代谢紊乱及纤维化相关的病理标志基因的变化，发现脂联素(Adiponectin)、乙酰肝素酶(heparanase)、转化生长因子transforming growth factor-β(TGF-β)、和瘦素受体(leptin receptor)、血小板衍生生长因子PDGF-a、PDGF-b等在注射的斑马鱼幼体的表达水平明显升高，说明斑马鱼幼鱼肝细胞已开始发生脂肪变性和纤维化。同时还检测到与HCV感染相关的病理相关基因，如Argsyn、ScarF2、AHSG、Rasgbd、HSC70、Chemokine(1)、ETFA、LeugPCR、Erlin1等，其表达量较野生型斑马鱼均有显著增加。这些结果表明，HCV IRES介导结构蛋白Core翻译的斑马鱼模型是成功的。用抗HCV阳性药物利巴韦林(Ribavirin)、干扰素(IFN)、候选药物苦参素(Oxymatrine)、类似物DM-122、辅助治疗药物维生素B12，及新型抗HBV药物替比夫定对本模型进行验证，结果表明，维生素B12能够剂量依赖性抑制IRES介导的翻译，苦参素和DM-122具有较弱的抑制活性，替比夫定能够同时抑制core和gfp的转录和翻译，而对翻译的抑制更明显。利巴韦林与干扰素在此模型上无IRES抑制活性。这些结果初步说明该模型可以用于抗HCV候选药物在IRES抑制活性方面的评价。　　 HCV NS5A表达模型及NS5A与Core共同表达的斑马鱼模型的建立:构建了由斑马鱼脂肪酸结合蛋白增强子与CMV启动子共同调控NS5A和红色荧光蛋白共表达的双顺反子基因构件pFC-5AiR，将其单独注射到斑马鱼受精卵后，能够检测到NS5A在肝脏内的表达;将pFC-5AiR与pFL-GIC共同注射斑马鱼卵后，NS5A与Core同时在肝脏表达并检测到肝脏病变标志基因的变化及与HCV感染相关的宿主基因的变化，发现Core的表达是促进脂肪变性的主要因素，而在纤维化的某些基因的表达上，Core与NS5A具有一定的协同效应，例如促进TGF-β、Hsc70、Argsyn、HMGR等的表达。这些结果表明，NS5A与Core共同表达的斑马鱼模型是成功的。该模型可用于研究Core与NS5A在肝脏病变机制方面的相互作用，也可以用于NS5A靶向的药物评价。　　 以上三种利用斑马鱼为模式生物建立的HCV亚基因相关的模型，可用以研究HCV致病的分子机制及对药物的翻译抑制活性进行评估等。同时这些结果也为利用斑马鱼作为HCV研究的动物模型提供了可能性。