糖基化修饰,是人体内蛋白质最普遍的修饰方式之一。N联糖基化修饰普遍存在于细胞外蛋白,比如体液蛋白、分泌蛋白、细胞膜蛋白等。精浆是精子(细胞)生存的外部环境,主要由睾丸和附属性腺分泌,富含体液蛋白和分泌蛋白,据此推测精浆中应该富含N联糖基化修饰的蛋白质。精浆样本相对容易获取,精浆中蛋白含量较血液和尿液更丰富,通过质谱和其他检测技术可以进行定性和定量检测。这都提示精浆N联糖基化蛋白质有潜力作为男性生殖系统疾病的无创性诊断标记物,有助于疾病的早期筛查和辅助诊断。糖基化修饰对蛋白质的结构和功能有重要影响,可以通过糖与碳水化合物相互作用,调控细胞粘附与识别,参与细胞间,细胞与细胞外基质相互作用。精浆糖基化蛋白质正是通过这些功能调控精子在女性生殖道的运输以及与卵子的结合。已知有为数不多的精浆蛋白被鉴定为N联糖基化蛋白,例如PSA、Glycodelin S、FN1、SEMG等,研究发现这些蛋白不同程度参与了男性生殖功能。虽然精浆中糖基化蛋白有非常重要的功能和临床意义,但我们对人类精浆N联糖基化蛋白质整体构成和功能的了解仍然有限,值得关注和开展研究。本项研究第一部分构建了一个高度可信的人类精浆N联糖基化修饰蛋白质谱系。构建糖基化蛋白质谱系方法为运用凝集素富集N联糖基化肽段,然后使用糖肽酶切割富集肽段结合串联质谱扫描。考虑到个体间糖基化蛋白质可能存在差异,进行了5次生物学重复鉴定(标本均来源自正常生育人群且精液参数正常),结果表明正常人群精浆N-糖基化蛋白质构成大致相似。本次研究共鉴定到372个糖基化蛋白和720个糖基化位点。为了进一步研究精浆中糖蛋白的功能,利用ToppGene软件进行GO与KEGG功能学分析。372个鉴定到的糖基化蛋白质对应到365个Entrez基因。精浆糖基化蛋白主要富集在细胞外区域(138基因)、溶酶体(76个基因)、细胞膜(61个基因),其中43%(160个蛋白)是分泌蛋白,最显著的生物进程与细胞粘附有关(涉及78个基因),功能分析提示精浆糖基化蛋白质可能调控精液凝固与液化,精子运动与获能,并参与精卵识别与融合。比较本研究与已发表男性生殖系统生物标志物发现,我们鉴定到的糖基化蛋白质有11个是附睾特异性,10个是睾丸特异性,4个是精囊特异性,3个是前列腺特异性,提示这些糖基化蛋白可以作为生殖系统和不育症的诊断标记物。研究的第二部分着重观察精浆糖基化蛋白质和生化指标,精子参数对精子前向运动的影响。研究发现弱精组较正常组的精子浓度(64.6±33.8 VS88.4±44.1)×106/ml,正常形态率(9.4±5.3 VS 12.9±5.6)%明显下降,有统计学意义,说明精子前向运动与精子浓度和形态密切相关。精浆果糖浓度与精子前向运动比例(r=0.21),精子总活力(r=0.25)均呈正相关,有统计学意义。我们挑选4个精浆糖基化蛋白质(LTF,FN1,SEMG2,WFDC2)进行免疫印迹实验,结果发现LTF和精子前向运动有相关性,精浆中LTF表达量在弱精组较正常组明显下降,有统计学意义(P<0.01)。LTF由精囊腺和前列腺分泌,提示附属性腺分泌不足影响精子前向运动。第二部分研究结果表明精子本身质量在精子前向运动发挥基本作用,这由睾丸生精功能决定的;而附属性腺分泌的精浆蛋白如糖基化蛋白发挥重要调控功能。进一步的研究可以观察体外添加LTF对精子运动的影响,探讨精浆中LTF分泌的影响因素和调控精子运动的机制。