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麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141）能特异性识别底物麦芽寡糖基海藻糖的海藻糖部分,并通过水解作用生成海藻糖。产物海藻糖由于具有保湿、防晒和低甜度等特点,被应用于生物医药、食品和日化等行业。来源于嗜酸热硫矿硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909）的MTHase具有制备海藻糖的优良性能,但在其重组制备过程中容易形成较多包涵体,影响可溶性表达,导致使用成本高。本研究对S.acidocaldarius MTHase进行改造:基于多重序列比对,选取21个疏水氨基酸进行替换以提高MTHase的可溶性表达。以获得的突变体L202P/L218D/Y323G的质粒为模板,通过随机突变,筛选获得有效突变体。对有效突变体进行饱和突变和叠加突变,得到最佳突变体。在最佳突变体摇瓶发酵的基础上进行3 L罐发酵优化。主要研究结论如下:（1）对S.acidocaldarius MTHase进行多重序列比对,选择非保守区域的位于蛋白表面的21个疏水氨基酸,替换为相同位点上的其他来源的亲水氨基酸（除了202位点:其他来源的此位点是疏水氨基酸）,研究蛋白可溶性表达。突变体Y21Q、L77E、L202P、L218D和Y323G酶活分别提高1.2、1.4、1.3、1.3和1.4倍,通过叠加突变,其中突变体L202P/L218D/Y323G酶活最高,达到59.4 U·mL-1,该突变体酶活提高1.9倍。（2）对突变体L202P/L218D/Y323G进行酶学性质研究。结果显示,与野生型酶比较,氨基酸的替换对MTHase酶学性质的影响甚微。该突变体酶活提高是因为蛋白表达量的提高。（3）以突变体L202P/L218D/Y323G的质粒为模板,通过随机突变构建突变文库并结合高通量快速筛选,最终获得两株酶活提高的突变体。突变体抽提质粒,进行测序确认突变位点,对有效突变体进行饱和突变和叠加突变,最终获得的最佳突变体M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T（简称突变体MTHasem）酶活比野生型高2.4倍。（4）对最佳突变体进行酶学性质研究,结果显示突变体的酶学性质与野生型相似。将突变体与实验室保存的相同来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15）共同作用麦芽糊精（DE值5-7）生产海藻糖,结果显示海藻糖转化率未受到较大影响。（5）对突变体MTHasem进行3 L罐发酵优化,最佳发酵条件为:发酵前期37℃恒温培养,当OD600达到50时,温度降低至30℃,恒速流加乳糖(流速为0.1 g·L-1·h-1)进行诱导。诱导27 h,该突变体的酶活最高达到444.8 U·mL-1,约为摇瓶发酵酶活的5.9倍。