论文部分内容阅读
目的本研究通过给小鼠原位接种C26结肠癌及荷瘤小鼠重复灌胃环磷酰胺建立肿瘤化疗肠道黏膜损伤的模型,检测各项黏膜免疫指标,了解本模型黏膜免疫学特征,并观察中医非药物疗法麦粒灸对肿瘤化疗肠道黏膜损伤的治疗作用及其黏膜免疫机制。并通过检测血清中相关的细胞因子,并与黏膜免疫部位进行比较,观察黏膜免疫与系统免疫的相关性。本研究分为三个部分:一、C26结肠癌荷瘤及环磷酰胺化疗小鼠模型的建立及其黏膜免疫特点初探:(1) 用C26原位结肠癌荷瘤小鼠及环磷酰胺化疗小鼠建立肠道黏膜免疫抑制模型。(2) 对模型的黏膜免疫特点进行研究。① 建立肠道黏膜免疫各部位淋巴细胞分离方法② 对黏膜免疫各部位淋巴细胞表面标记的研究③ 对黏膜部位细胞因子的研究。二、麦粒灸对荷瘤及环磷酰胺化疗小鼠黏膜免疫功能影响:(1) 对黏膜免疫各部位淋巴细胞表面标记的影响(2) 对黏膜部位细胞因子的影响三、麦粒灸对荷瘤及环磷酰胺化疗小鼠血清中细胞因子的影响。主要实验方法:BAILB/c小鼠,随机分组(见实验部分)。对荷瘤模型组,麦粒灸组,环磷酰胺组,环磷酰胺加灸组小鼠接种肿瘤细胞:麻醉状态下打开小鼠腹腔,将20 μl C-26肿瘤细胞(共1×106) 接种于盲肠浆膜下,缝合腹壁。造成荷瘤小鼠黏膜免疫功能下降模型。假、手术组:开腹,盲肠浆膜下注射20 μl生理盐水,缝合腹壁。环磷酰胺组,环磷酰胺+麦粒灸组以接种后第一日至第十二日为止,给予0. 9%生理盐水200μl灌胃,第十三日起,至十七日,每日给予环磷酰胺200μl(总计量为5mg)灌胃。麦粒灸组及环磷酰胺加灸组造模开始后,于接种次日开始施治,施灸局部剃毛露出皮肤,使用日本产艾绒制成半米粒大艾柱,放置于穴位相对部位,用线香点燃,每日一次,每次一壮,用补法,连续施治十七天,于最后一次施治后24小时处死动物。统计PP结面积,用病理学方法观察动物小肠黏膜病理形态变化,分离黏膜免疫各部位的淋巴细胞,用免疫荧光染色和流式细胞术检测肠黏膜中上皮内淋巴细胞(iIEL)、固有层淋巴细胞(LPL)及Peyer’s Patch(PP结)中T细胞亚群,用免疫荧光染色法观察小肠黏膜局部IL-2,IL-10表达。摘眼球取血,全血2000rpm,10min离心后取血清,用ELISA测定血清中IL-2、 IL-10含量。结果:一、C26结肠癌荷瘤及环磷酰胺化疗小鼠模型的建立及其黏膜免疫特点初探北京中医药大学医学博士毕业论文1.1瘤重和环磷酞胺的抑瘤率检测结果显示:荷瘤模型组瘤重平均为1.62士0.73克,环磷酞胺组瘤重平均为1 .01士0.46,两组比较有显著性差异(P刃.001),环磷酞胺组抑瘤率为37.65%。确认C26原位结肠癌模型及环磷酞胺化疗模型造模成功。1 .2统计假手术组、荷瘤模型组及环磷酸胺组小鼠肠PP结面积,进行荷瘤模型组小鼠瘤重和即结面积的相关性分析,结果显示:荷瘤小鼠到中瘤影响,肠逞护P结的面积明显减少(P<0.001),机体豁膜局部免疫功能受抑;而环磷酸胺细琢誉P结的面积进一步减少(P<0.001),说明环磷酞胺进一步抑制了荷瘤小鼠本已受损的勃膜免疫功能。肿瘤重量与小鼠的PP结面积呈明显的负相关(r=刃.59725),小卿P结面积脚中瘤的增大而减小。结果提示:C--26原位结肠癌小鼠和环磷酞胺治疗的荷瘤小鼠均可作为勃膜免疫功育狮带蟆型。1 .3大体及光镜下观察小肠豁膜病理变化:假手术组小肠肠壁较厚,即结数量虽较多,突出肠壁,厚度明显大于周围肠壁。荷瘤模型组肠壁粘连,肿瘤侵万田汤壁,肠壁厚度比假手术组略薄,即结数量比假手术组减少,即结直径变小。环磷酞胺组肠壁薄而易断,PP结数量明显减少,即结直径变小,甚至部分动物无肉眼可见的即结。光镜下假手术组小肠勃膜绒毛完整,上皮细胞排列整齐紧密。荷瘤模型组勃膜及豁膜下肌层明显变薄,上皮细雕川卜列不紧密,勤膜固有层细胞数量较少。化疗组小肠绒毛圆钝,上皮细胞引陌叮疏松,间距增加,部分上皮细胞可见空泡变性。上皮细胞核固缩,深染,部分胞核崩解,淡染。豁膜固有层细胞数明显减少。豁膜上皮及浅表的腺体剥脱,勃膜上皮局灶性坏死,腺体数目减少。肌层变薄。1.4,J、肠勃膜免疫各部位淋巴细胞的分离方法的建立:通过胎盼蓝染色及石蜡切片和HE染色对淋巴细胞活性及小鼠小肠勃膜的解离程度进行了检测,用流式细胞分析仪对所分离的肠勃膜淋巴细胞进行了鉴定。经分离纯化步骤,每只鼠可获筱阳币x1o外iIEL,2--5x IJ个LpL那一10X106个Pp结淋巴细胞,活力>9既。病理切片显示:经消化液振荡消化后,小鼠小肠绒毛勃膜上皮除肠隐窝处外,基本与固有层分离,有些部位甚至完全脱落。同时勃膜固有层及淋巴小结保持完整。胶原酶消化后可见固有层解离而勤膜肌层保持完整。以上结果提示:本实验成功地分离了肠道勤膜各部位淋巴细胞,且分离方法稳定,高效。1 .5流式细胞分析仪检测各组小鼠小肠勃膜各部位淋巴细肪犷D3、CD4、CDS表面标志结果显示:iIEL中CD4干的淋巴细胞百分比,假手术组明显高于荷瘤模型组和环磷酞胺组(P<0.001),环磷酞胺组CD4+的淋巴细胞与荷瘤模型组相比有阳氏的趋势(卜0.141)。LPL中CD4+的淋巴细胞百分比,假手术组高于荷瘤模型组(P旬刃44),更明显高于环磷酞胺组(P<0.001),环磷酞胺