分枝杆菌属包括致病性结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌,目前仍然是人类健康的巨大威胁。分枝杆菌的科学研究都需要有效的分子遗传操作技术,尤其是快速有效的基因突变及基因敲除的分子操作技术。但是由于分枝杆菌生长缓慢、重组酶活性较低等原因,在分枝杆菌内的基因操作技术包括基因敲除技术的发展一直落后于其他模式生物。我们在Xer/dif敲除系统的基础上开发了一种高效、通用、完善的基因敲除系统。我们在pJV53质粒中引入gfp报告基因,用于快速筛选在重组后丢失的质粒；构建了dif-hyg-dif, dif-zeo-dif表达盒,在表达盒两边加了多克隆酶切位点便于上下游同源臂的插入；随后我们利用该系统对耻垢分枝杆菌的4对毒素-抗毒素基因进行了连续的读码框内敲除,表明该系统可成功用于分枝杆菌多基因的连续敲除,为分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具。我们对结核分枝杆菌中的毒素-抗毒素系统进行了初步的研究,新发现了6个在耻垢分枝杆菌中有功能的毒素-抗毒素基因。此外,我们发现12个毒素-抗毒素基因在耻垢分枝杆菌中具有稳定质粒的功能,这说明它们可能参与调控结核分枝杆菌基因组的稳定。该研究为进一步研究毒素-抗毒素系统在结核分枝杆菌中的功能打下基础。