网状内皮组织增生病病毒的不同鉴定方法及其长末端重复序列的克隆和序列分析

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根据已发表的网状内皮组织增生病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR),人工合成一对能特异地扩增REV LTR序列的引物。分别从山东、江苏、上海等地的大型鸡场中,收集疑为REV感染的鸡的脾脏和肝脏,提取组织DNA,并以此为模板,通过聚合酶链式反应(PCR),从来自山东泰安、江苏海安、如皋以及上海等地的鸡场采集的样品中,分别从REV的前病毒cDNA中扩增到了REV的LTR序列。所收集的56份样品中,有21份样品呈PCR阳性。将不同地区REV LTR的PCR产物,克隆进TA载体进行序列测定,结果表明,该基因的保守性大于93%,而且上海某鸡场和如皋某鸡场分离株的LTR序列完全相同。 用本实验室标记的REV前病毒基因组探针进行斑点杂交(dot-hybridization)试验,对不同地区的样品进行验证分析,结果在56份样品中,有20份斑点杂交阳性,除第31#样品外,其中有19份PCR阳性。 将PCR和dot-hybridization的阳性样品碾磨、离心,上清经过滤后,接种96孔板鸡胚成纤维细胞(CEF)单层分离病毒,七天后,用针对REV的单克隆抗体(11B118株)进行间接免疫荧光试验(IFA)检测。结果发现:56份样品中,有15份IFA阳性,且所有IFA阳性样品,PCR和Dot-blot检测都呈阳性。 本研究表明,由于REV病毒自身的特点,在以REV前病毒cDNA为探针进行斑点杂交检测时,阳性检测率可能低于实际感染率。IFA作为检测方法因需培养细胞,时间长。REV的LTR序列比较保守,可作为该病毒特征性的保守区进行PCR检测和斑点杂交检测。本实验所收集的样品,来于相距较远的不同地区,因而,实验同时证实了REV在我国的广泛流行。
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