系统性念珠菌感染分子诊断的初步研究

来源 :中国协和医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zybmc
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系统性念珠菌病是免疫抑制患者如应用抗肿瘤药物治疗、接受器官移植以及心脏和腹部手术当中,常见的医院内感染之一。念珠菌血症患者预后比细菌血症患者还要差。尽管接受足够的治疗,系统性念珠菌病的病死率仍很高,约为50%-80%。而在感染早期,血培养的敏感性较低。最近,非培养分析技术如PCR已开始应用于系统性念珠菌感染的早期诊断之中。 以前的研究证实,PCR既可用于检测血标本中的念珠菌,也可用于检测尿标本中的念珠菌。然而,还没有在同一个实验当中同时用PCR比较血和尿标本的研究报道。在血标本中,至少存在两种样本一全血和血浆。同样,尿标本也至少有两种类型-上清液与尿沉淀。由于离心使真菌细胞沉淀但不会破坏其完整结构,所以在血浆和尿上清中只可能存在游离的真菌模板DNA。相反,当采用全血或尿沉渣时,其标本中可能既存在游离DNA也存在细胞内DNA。然而,由于血和尿中存在PCR抑制物如血红蛋白和亚硝酸盐等,首先要通过血细胞裂解和洗脱去除。因此,所采用的标本不同,检测DNA的来源也存在差异。这可能导致敏感性及其临床意义不同。就我们阅读文献所及,这一问题还没有被深入研究过。故我们采用念珠菌感染小鼠实验模型,扩增其编码18SrRNA的基因,比较了血和尿标本PCR的阳性检测率,并与培养阳性率作比较。 为了便于研究,我们将实验分为三个部分: 第一部分,我们采用符合“国际实验动物索引”的远交品系小鼠ICR,以腹腔注射环磷酰胺降低免疫,再从静脉攻击白念珠菌造成系统感染,从而建立免疫抑制小鼠白念珠菌急性系统性感染模型,并观察了其感染特征。 第二部分,我们参考国外文献,并结合本实验特点,初步建立了一套以玻璃珠破壁、以饱和氯化钠去除蛋白质、以无水乙醇沉淀核酸的基本DNA提取技术。同时,根据不同的临床标本、不同的检测目标适当调整之。体外敏感性实验证实,最低可从标本中检测出100CFU的菌量。 第三部分在第一、二部分成熟技术的基础之上,进一步比较不同检测方法(PCR和血培养)、不同组份的临床标本(血浆与全血,尿上清液与尿沉渣)在动态检测不同免疫状态下小鼠系统性白念珠菌感染中的差异。 对于免疫正常小鼠,血培养和尿培养在小鼠感染念珠菌第七天时才出现阳性结果,血浆PCR阳性结果最早出现在第二天,下来是全血PCR在第三天,而尿上清和尿沉渣则同时在第四天出现阳性结果。血培养与血浆PCR间(P=-0.006)、血培养与全血PCR间(P=0.031)存在显著性差异。血浆与全血PCR间、尿培养与PCR方法间未见统计学差异。 对于免疫抑制小鼠,在小鼠感染念珠菌第六天时出现血培养和尿培养阳性,血浆PCR阳性结果最早出现在第一天,下来是全血PCR在第二天,而尿上清和尿沉渣仍同时在第四天出现阳性结果。血培养与血浆PCR间(P=-0.003)、血培养与全
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