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油菜素内酯(Brassinosteroid, BR)是调控植物生长发育的一类非常重要的激素,对株高、叶夹角、育性等重要农艺性状均具有调控作用,并可提高植物对逆境(寒、冷、盐、旱、高温、低氧等)的抵抗能力,在农业生产上具有重要的应用价值。但作为胞外信号的BR,如何把信号传递到胞内来调控植物的生长发育过程尚不明确。Ca2+是植物体内公认的第二信使,同时也是构成细胞的大量元素,参与外界信号向细胞内的传导过程,胞质游离钙的变化,是细胞响应各种刺激信号的初始事态,由此诱发随后一系列信号转导的下游事态。为研究BR对Ca2+信使系统的影响,本研究以拟南芥和玉米为材料,采用焦锑酸钙沉淀法对BR处理后Ca2+的分布进行了细胞化学定位；利用Real-Time PCR技术对调控细胞内Ca2+水平的位于细胞质膜、液泡膜和内质网上的编码Ca2+-ATPase的基因及位于细胞质膜、液泡膜和溶酶体上的编码Ca2+通道基因的表达量进行了分析；为进一步阐明BR对Ca2+信号转导系统的影响,此外,对BR处理后Ca2+结合蛋白CaM相关基因也进行了表达量变化分析,主要结果如下：1、BR对植物细胞Ca2+分布的影响研究发现,未经BR处理的拟南芥细胞中,Ca2+主要分布在细胞壁、细胞间隙和液泡,细胞质和叶绿体中仅有少量Ca2+的分布;在1000nmol/LBR处理3h后,Ca2+呈聚集状分布在液泡膜和细胞质膜附近,疑似欲通过细胞质膜或液泡膜上的Ca2+通道进入细胞质或通道关闭阻滞了Ca2+的通过,同时细胞质和叶绿体上Ca2+分布增多；BR处理6h后,细胞质和叶绿体中Ca2+分布继续增加,细胞壁中Ca2+分布有所减少；BR处理9h后,细胞质和叶绿体中Ca2+分布减少,细胞间隙和液泡中Ca2+分布有所增加,但细胞壁中Ca2+分布明显减少。说明BR具有移除细胞壁中Ca2+的作用。BR对玉米叶片细胞中Ca2+的分布的影响与拟南芥叶片中的类似。2、BR影响植物细胞Ca2+分布的机理研究(1)BR对Ca2+通道相关基因表达量的影响。CNGC2和CNGC12是细胞质膜上编码Ca2+通道的基因,在1000nmol/L BL处理3h后,CNGC2和CNGC12的表达量均明显下降,说明BR可阻滞胞外Ca2+进入细胞质：在1000nmol/L BL处理6h后,CNGC2和CNGC12的表达量有所恢复,到1000nmol/L BL处理9h后,CNGC2和CNGC12的表达量明显增加。TPC1和TPC2分别是液泡和溶酶体上钙离子通道相关基因。TPC1和TPC2的表达量在1000nmol/L BL处理3h后也表现为明显下降,但TPC1的表达量在1000nmol/L BL处理6h后的表达量明显高于未用BR处理的对照,而TPC2的表达量直到1000nmol/L BL处理9h后才明显升高。可见,BR可阻滞细胞质中Ca2+浓度的快速上升,液泡膜上编码Ca2+通道基因的表达恢复早于细胞质膜和溶酶体上的Ca2+通道基因,说明液泡中Ca2+大量进入细胞质的时间早于胞外钙库和溶酶体等胞内细胞器。(2)BR对编码Ca2+-ATPase相关基因表达量的影响。ACA8和ACA10是定位在细胞质膜上Ca2+-ATPase基因,1000nmol/L BR处理3h和6h后,ACA8和ACA10的表达量没有明显的变化；BR处理9h后,ACA8和ACA10的表达量明显增加；ACA4和ACA11是液泡膜上编码Ca2+-ATPase的基因,BR处理后,ACA4和ACA11的表达量变化与质膜上的ACA8和ACA10的表达变化类似。ACA2是内质网上编码Ca2+-ATPase的基因,ACA2的表达量同样在1000nmol/LBR处理9h后出现了表达量的最高峰。可见,BR处理9h后,Ca2+-ATPase表达量增加,把细胞质中高浓度的Ca2+泵入细胞间隙、液泡和内质网等胞外和胞内钙库中,调控细胞质中的Ca2+稳态。3、BR对Ca2+结合蛋白CaM相关基因表达量的影响在对CaM相关基因进行半定量分析时,发现在1000nmol/L BR处理拟南芥3、6、9h后,CAMl、CAM2、CAM4、CAM6、CAM7等基因表达水平均下调。说明BR可降低CaM相关基因的表达,调控钙离子的信号转导过程。4、CAM7在BR调控的植物生长发育过程中起负调控作用过表达CAM7的拟南芥植株矮小、发育延迟。BR合成基因和信号转导相关基因表达量下降。说明CAM7在BR调控的植物生长发育过程中起负调控作用。综上所述,BR处理首先通过抑制钙离子通道的表达量,阻滞细胞质中Ca2+的快速上升,但随着BR处理时间的延长,液泡、细胞壁和细胞间隙、内质网和溶酶体中的Ca2+先后通过Ca2+通道进入细胞质中；与此同时,BR处理9h后Ca2+-ATPase的活性明显增强,加大细胞质中钙离子的外排,让细胞维持在一个稳定的钙离子环境中。Ca2+结合蛋白CAM7在BR调控的植物生长发育过程中起负调控作用。