背景及目的抗生素通常用于治疗医院细菌性感染和防治动物疫病,被广泛应用于医疗卫生、农业养殖等领域。由于抗生素的不合理使用,导致细菌耐药性加速增强,成为导致患者治疗失败、住院时间延长、医疗费用升高以及病死率增加的重要原因。预计到2050年,细菌耐药将导致全球范围内超过1000万人死亡,甚至超过肿瘤,位居各类疾病死因的首位。若不及时采取控制行动,人类面临感染性疾病的威胁将愈加严重,给社会经济的发展以及人类健康带来难以估量的影响。中国是全球最大的抗生素生产和消费国之一,仅2013年的抗生素消耗总量高达16.2万吨。滥用抗生素可能对人体健康造成损害,可诱导细菌耐药性的产生,增加临床交叉感染的风险,以及引起药物不良反应。抗生素进入人或动物体内不能被机体完全代谢,大约30%至90%的抗生素以母体化合物或活性代谢产物形式通过人或动物的尿液和粪便排入环境。因此,环境中抗生素的生态风险以及其对人体健康的影响需要进行合理评估。环境各介质中不仅存在抗生素残留,也是耐药菌(ARB)/耐药基因(ARGs)的存储库。环境处于“动物-环境-人类”(One-Health策略)耐药传播链的中心环节,在ARB的传播过程中起到至关重要的作用。因此,遏制耐药菌的传播,不仅是临床与养殖业面临的挑战,环境领域亦责无旁贷。截止目前,关于ARB研究多聚焦于单一环境介质,缺乏多环境介质ARB传播的整体性研究,跨介质传播机制和驱动力亦尚未厘清。尤其是农村养殖地区,由于缺少处理禽畜粪污的专用设施,大量的养殖废弃物被直接排放至周围环境。因此,农村畜禽养殖环境中ARB跨介质传播及其驱动力成为关注的热点,这是对养殖区进行抗生素/ARB进行污染限控的理论基础。超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum β-Lactamases,ESBLs)是一类由质粒介导,能使细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的酶,常见于大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌等。CTX-M型是目前ESBL最主要的基因型别,在全球范围内广泛流行。携带CTX-M的大肠杆菌在环境各介质被频繁报道,可作为环境ARB的指示菌,其高检出率为研究ESBL的跨介质传播提供了机会。因此,本研究通过检测农村畜禽养殖环境多介质中的抗生素残留,评估环境中抗生素耐药性发展的生态风险和人类健康风险;利用养殖环境中携带CTX-M大肠杆菌的流行特征,揭示ARB的传播途径及其驱动因素。方法1.通过高效液相色谱-串联质谱法对环境样本中的抗生素残留进行定量分析。测量的环境浓度与预测的无效应浓度的比值(risk quotient,RQ)用于评估抗生素耐药性发展的生态风险。分别利用饮用水中抗生素的实测浓度与预测的无效应浓度、蔬菜中抗生素的每日摄入量与每日容许摄入量的比值来评估抗生素残留对人体的健康风险。2.通过细菌的分离、筛选和鉴定过程,获得携带CTX-M大肠杆菌;通过药敏试验、PCR实验分别确定目标菌株的耐药表型和耐药基因型;通过脉冲场凝胶电泳实验与多位点序列分型技术确定目标菌株的同源性和分子分型。结果1.农村畜禽养殖环境中存在甲硝唑、磺胺嘧啶、诺氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、强力霉素、磺胺甲恶唑、氟苯尼考和氯霉素的残留。河水、废水、饮用水、河流沉积物、猪粪、出口沉积物、土壤、蔬菜中高残留水平的抗生素种类分别是氟苯尼考(3.9 ng/L)、左氧氟沙星(12.5 ng/L)、环丙沙星(21.4 ng/L)、氯霉素(1.12 μg/kg)、强力霉素(1.91 μg/kg)、左氧氟沙星(11.68 μg/kg)、氯霉素(2.5 μg/kg)和氯霉素(27.2μg/kg)。2.恩诺沙星、左氧氟沙星残留可能导致的抗生素耐药发展的RQ值大于1,环丙沙星的耐药发展RQ值为0.1～1。成年人和儿童通过饮用水暴露抗生素的RQ值均小于1,由蔬菜摄入而接触抗生素的RQ值均小于0.1。3.在231个环境样本中共分离88株携带CTX-M大肠杆菌,其中不同环境介质的阳性菌株检出率分别为:猪粪(73%)>河水(64%)>河流沉积物(52%)>废水(31%)>饮用水(23%);>出口沉积物(21%)>土壤(17%)>蔬菜(4.4%)。药敏结果显示所有菌株对头孢噻肟耐药,大部分菌株对四环素、甲氧嘧啶-磺胺甲恶唑和氟苯尼考耐药。4.多位点序列分型结果显示88株目标菌株属于57个ST型,以ST10(n=10)、ST48(n=7)、ST3489(n=4)、ST34(n=3)、ST1638(n=3)、ST206(n=2)、ST226(n=2)、ST542(n=2)、ST602(n=2)、ST1011(n=2)、ST2526(n=2)、ST2614(n=2)和ST2973(n=2)为主要的ST型别。脉冲场凝胶电泳实验结果发现携带CTX-M大肠杆菌呈现高度克隆多样性,基于该结果构建系统发育树,共鉴定了 23组具有同源性的分离株,其中18组菌株来源于不同的环境介质。结论1.研究区的畜禽养殖环境中普遍存在抗生素污染。废水中的恩诺沙星、左氧氟沙星和环丙沙星可能导致抗生素耐药发展的生态风险。通过饮用水和蔬菜暴露的抗生素对人体未造成直接健康风险,但可能存在抗生素耐药产生的风险。2.根据分离菌株的遗传相关性,发现养殖环境中存在以下四种传播途径:从猪废弃物到水环境;水环境间;从水环境到土壤;野鸟引起的传播。人为活动、气象事件和鸟类影响了 ARB跨介质传播,其中施肥、灌溉等人为活动有利于ARB从动物粪便到环境的扩散,干旱作为保护因素阻碍ARB随着河流向远距离扩散,野生鸟类作为ARB的传播载体促进远距离扩散。