论文部分内容阅读
G3BP(Ras-GTPase-activatingproteinSH3domain-bindingproteins)是第一个分离得到的RasGAPSH3结构域结合蛋白，具有G3BP1和G3BP2两个亚型。G3BP在多种肿瘤组织和细胞中高表达，包括肺癌，乳腺癌，结直肠癌和头颈部癌等。同时G3BP也参与了肿瘤发生发展的多条信号通路，包括Ras信号通路，NF-kappaB信号通路和泛素-酶体途径（主要是USP10）。G3BP还与肿瘤的侵袭转移密切相关。G3BP1是组成应激颗粒的重要蛋白，在应激颗粒中，G3BP能与一些RNA结合，从而决定它们翻译的起始和阻遏。已经发现G3BP能够转录后调控与侵袭转移相关基因的表达来影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。
RasGAP是Ras活性的负调控蛋白，同时又参与Ras信号的传递，与细胞增殖，迁移和凋亡相关。研究发现只有在增殖的细胞中才能免疫共沉淀得到G3BP与RasGAP复合物。该结果提示，当Ras处于活性状态时，G3BP与RasGAP结合。同样有研究发现只有在生长的细胞中才能免疫共沉淀得到G3BP与RasGAP，并且依赖于Ras的活化状态。这进一步提示G3BP可能通过GAP参与Ras活性调节，而且参与Ras的信号传导。
基于以上认识，我们认为G3BP可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点，阻断RasGAP与G3BP的结合可能是一个新的肿瘤治疗策略。
1．下调G3BPs能够抑制肿瘤细胞生长
RNA干扰技术主要通过外源导入与靶基因mRNA互补的双链RNA，从而抑制靶基因的蛋白表达。本研究选取G3BPs表达水平较高的HCT116和H1299细胞，通过化学合成的21个核苷酸的短干扰核糖核酸(siRNA)瞬时沉默两个细胞中G3BP的表达水平，观察其对肿瘤细胞增殖生长的作用。我们发现G3BPs干扰后抑制了HCT116和H1299细胞的生长，并且引起细胞的凋亡。
另外，我们构建了G3BPs稳定下敲的H1299/G3BPs(-)细胞株，不管是G3BPs稳定下敲的单克隆细胞株H1299/G3BPs(-)-sc，还是G3BPs稳定下敲的多克隆细胞株H1299/G3BPs(-)-mc都显著影响了H1299细胞的增殖和生长。
2．G3BPs参与肿瘤细胞的迁移侵袭
G3BPs参与肿瘤细胞的迁移侵袭。我们发现下调G3BPs后能够降低肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力。我们检测了用siRNA瞬时沉默G3BPs的肿瘤细胞或G3BPs稳定下敲的H1299细胞株，结果肿瘤细胞的迁移侵袭能力都明显降低了。同样我们发现针对G3BP设计的多肽药物也能够显著的抑制肿瘤细胞的转移侵袭能力。G3BPs下调抑制肿瘤细胞的迁移侵袭能力与抑制FAK/ERK/NF-κB信号通路有关。
3．靶向G3BP设计的多肽药物的抗肿瘤作用
RasGAPSH3结构域与G3BP的NTF2样结构域结合，参与RasGAP的信号传导。用计算机模拟了RasGAP与G3BPNTF2样结构域的结合模型，并且认为RasGAP301-326肽段与G3BP具有很强的结合能力。我们将RasGAP30l-326肽段加上十个氨基酸的穿膜肽TAT，合成了一个新的多肽药物38GAP。在体外增殖抑制实验中，我们用台盼蓝拒染法和克隆形成实验发现38GAP对HCT116细胞具有明显的增殖抑制作用，IC50为38.76μM。我们发现38GAP能够引起HCT116细胞的凋亡，并且是依赖于caspase通路的。38GAP能够抑制ERK、Akt和NF-kappaB的活性。
根据上面提及的计算机模拟的RasGAP与G3BPNTF2样结构域的相互作用模型，我们又设计了理论上与G3BP结合能力更强的全新氨基酸序列的GAP161多肽药物。我们观察了GAP161随时间变化进入细胞的过程，以及与G3BP的相互作用。我们发现GAP161在体外具有更好的增殖抑制作用，能够诱导细胞凋亡。GAP161能够阻断RasGAP与G3BPs的作用，并且下调G3BPs蛋白，从而抑制Ras信号。在体内裸鼠移植瘤模型中GAP161单药具有明显的抑瘤作用，与顺铂联用具有显著的协同作用。
4．下调G3BPs能够促进肿瘤细胞对化疗药物的敏感性
38GAP能够增加HCT116细胞对传统化疗药物顺铂(CDDP)的敏感性。在HCT116细胞中，CDDP引起的ERK和NF-kappaB的激活能够抵抗CDDP的细胞毒作用。38GAP与CDDP联合后能够抑制CDDP引起的ERK和NF-kappaB的激活，从而提高顺铂的作用。用G3BPs-siRNA处理细胞后能够显著提高CDDP的细胞毒作用。在体内实验中，我们用小鼠结肠癌CT26BALB/c移植瘤模型对38GAP的抗肿瘤作用进行了评价。38GAP单药25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg剂量组的具有一定的肿瘤抑制率，分别为15％、18％和23％。CDDP单药1mg/kg具有38％的抑制率，两药联合后的抑制率分别为41％、45％和60％。
同样，GAP161与CDDP联用后也能够显著提高顺铂的细胞毒作用，并且这种增敏作用是通过抑制Ras的活性形式RasGTP以及Ras下游信号通路来实现的。
综上所述，G3BPs参与细胞的生长、运动和侵袭，下调G3BPs能够降低细胞的增殖生长，引起细胞凋亡，抑制细胞的迁移侵袭能力。针对G3BP设计的多肽药物能够阻断RasGAP与G3BPs的结合，同时能够下调G3BPs蛋白，抑制Ras活性，从而能够明显抑制细胞增殖生长，引起细胞凋亡。下调G3BPs能够增加细胞对化疗药物CDDP的敏感性。多肽药物还能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。G3BP有可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。