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热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是一类单体分子量90kD左右的分子伴侣蛋白,广泛存在于原核和真核生物中。该类蛋白高度保守,且在细胞中含量丰富,为细胞生存所必需,参与折叠及调控多种与信号转导及细胞周期调控相关的蛋白,在维持蛋白质稳态中发挥重要作用。因其顾客蛋白(Client proteins)多与细胞增殖及肿瘤进展相关,Hsp90成为抗肿瘤药物设计的关键靶点。Hsp90在真核细胞中有α和β两个亚型,以α-α或β-β的二聚体形式发挥活性。其N端为ATP结合结构域,具有ATP酶活性,可与抑制剂或辅分子伴侣结合;中间结构域主要与顾客蛋白及辅分子伴侣结合;C端结构域主要负责其二聚化。已有电镜及晶体结构解析表明,Hsp90功能的发挥通过其N端结合ATP驱动瞬时的二聚化及ATP水解后二聚化打开的这种由闭合到开放状态的构象变化完成。生活在海平面7000m以下的马里亚纳海沟的一种深海狮子鱼(Pseudoliparis swirei)的基因组中,hsp90基因有五个拷贝,且其中四个拷贝均在N端结构域的一保守位点发生了重复性固定突变。据同源建模结果分析,该突变位点紧邻ATP结合口袋,可能与组成该活性口袋的部分氨基酸存在互作,从而影响Hsp90活性,猜测这一突变可能引起的结构和功能变化与该种狮子鱼适应深海静水压力有关。为揭示这种独特的突变对狮子鱼Pseudoliparis swirei的Hsp90的结构和功能的影响,需首先获得该物种的Hsp90蛋白。由于实验原材料难以获得,本论文尝试通过外源重组表达的方式对该蛋白进行表达及纯化。目前在对Hsp90蛋白进行结构或功能研究时,最为常见的是使用大肠杆菌表达系统进行外源表达获得蛋白,因此我们选择使用pET-28a质粒构建重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。为方便进行蛋白的分离纯化,先后在Hsp90蛋白的N端添加了His及Strep标签。经Western Blot(WB)和质谱鉴定分析,验证目的蛋白在大肠杆菌得到表达。通过亲和层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析等多种分离纯化手段,我们获得了一定纯度的Hsp90蛋白,并初步使用透射电镜对蛋白结构进行了观察。天然Hsp90具有ATP酶活性,我们通过敏感酶偶联测定体系对Hsp90水解ATP的活性进行测定。实验结果表明,我们原核表达得到的Hsp90蛋白具有酶活。本论文为外源表达纯化得到该物种Hsp90蛋白奠定了实验基础,并为进一步优化实验流程提高蛋白纯度以进行结构生物学研究提供了实验依据。