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本研究的主要目的是筛选出可利用甘油生产1,3-丙二醇的菌种,分离鉴定后测定1,3-丙二醇产量,选择产量较高的菌种化学诱变后筛选正突变菌株。以该菌株基因组DNA为模板,PCR方法得到1,3-丙二醇代谢途径关键酶编码基因dhaB、dhaT,构建底物范围宽广的产1,3-丙二醇基因工程菌。从无锡市卫生防疫站和无锡郊区农田筛选到挑选出可以以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇菌株共16株,从中挑选出产量较高的9株。经初步鉴定,该16株菌均为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),初步发酵试验表明,1192#肺炎克雷伯氏菌1,3-丙二醇产量为5.3 g/L,经过化学诱变以后1,3-丙二醇产量可达到20 g/L左右。利用PCR技术,以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)1192-121#基因组DNA为模板,以NCBI报道的Klebsiella pneumoniae ATCC 25955相关基因序列为参考设计引物,扩增出约4.6kb的编码甘油脱水酶基因dhaB和1.16kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT。将dhaT基因和dhaB基因分别置于tac启动子下游,最终得到重组质粒pEtac-dhaT,pUCtac-dhaB及pUCtac-dhaB-dhaT重组质粒。将上述重组载体转化大肠杆菌JM109得到重组菌E. coli JM109 (pEtac-dhaT)、E. coli JM109 (pUCtac-dhaB)、E. coli JM109 (pUCtac-dhaB-dhaT)和E. coli JM109 (pUCtac-dhaB, pEtac-dhaT)。重组菌E. coli JM109(pUCtac-dhaB)中甘油脱水酶酶活为104U/mg蛋白, E. coli JM109(pEtac-dhaT)中1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活为0.2U/mg蛋白。E. coli JM109(pUCtac-dhaB-dhaT)中甘油脱水酶酶活为153 U/mg蛋白,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活为0.17 U/mg蛋白。E. coli JM109(pUCtac-dhaB, pEtac-dhaT)中甘油脱水酶酶活为132U/mg蛋白,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活为0.08U/mg蛋白。重组菌的全细胞蛋白SDS-PAGE结果显示目的蛋白位置与预期位置相符合。甘油脱水酶大亚基约为64kD,1,3-丙二醇氧化还原酶约为40kD。250mL三角瓶中发酵培养基装液量50mL,培养基中添加CaCO3以维持pH值得相对稳定,发酵50 g/L甘油在IPTG诱导的情况下E. coli JM109(pEtac-dhaT)无1,3-丙二醇产生;E. coli JM109(pUCtac-dhaB)产生 1.1 g/L1,3-丙二醇;E. coli JM109(pUCtac-dhaB-dhaT)产生18.2 g/L1,3-丙二醇;E. coli JM109(pUCtac-dhaB, pEtac-dhaT)产生14.6 g/L1,3-丙二醇。发酵40 g/L葡萄糖在IPTG诱导的情况下E. coli JM109(pEtac-dhaT)无1,3-丙二醇产生;E. coli JM109(pUCtac-dhaB)的1,3-丙二醇分别产量为0.8 g/L;E. coli JM109<WP=8>(pUCtac-dhaB-dhaT)的1,3-丙二醇产量分别为9.1 g/L;E. coli JM109(pUCtac-dhaB, pEtac-dhaT)的1,3-丙二醇产量分别为8.2 g/L。