1目的人红细胞血型系统非常复杂,血型抗原的正确鉴别在保证输血安全、调查人种分布、建立稀有血型库及许多疾病的诊断、分型甚至治疗方面都有极其重要的作用。抗原的鉴别有赖于相应抗体的获得。而我国除ABO血型定型试剂外,其它临床及实验所用血型抗体几乎全部依赖进口,这极大地制约了血型学研究在我国的发展。本研究的目的即通过常规的杂交瘤技术及目前迅速发展的基因工程抗体技术制备针对各种血型抗原的单克隆抗体及基因工程抗体,以期获得效价高、特异性强并具有自主知识产权的血型抗体,为它们最终能大规模生产应用于临床及积极开展国际交流、互通有无打下坚实的基础。2方法根据实验目的,本课题内容共分三部分2.1红细胞血型单克隆抗体的制备分别用健康成人“O”血及胎儿脐血红细胞免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫及一次加强免疫,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过血凝试验初筛,保留血凝效价达4+的细胞株扩大培养,获得的杂交瘤细胞上清分别用谱红细胞、原核表达的Kell-30c血型抗原多肽及Western blot进行抗体特异性鉴定,同时进行抗体类型、效价及抗原表位的检测,对部分单克隆细胞株通过腹水扩大培养,以进一步提高其效价。2.2 ScFv_6D7C9-HPV16 E7双功能分子的制备用实验第一部分获得的一株抗红细胞血型糖蛋白GPA/GPB的杂交瘤细胞株6D7C9进行RT-PCR,分别扩增其VH、VL基因,并用Linker将其拼接成6D7C9的ScFv基因,转化原核表达载体pBAD/gIIIA,获得的阳性克隆命名为:pBAD-ScFv_6D7C9,通过Western Blot分析及间接血凝试验检测ScFv的蛋白表达及血凝活性。将获得的pBAD-ScFv_6D7C9与已有的人乳头瘤病毒16型E7基因片段（HPV16-E7）通过一Linker经PCR拼接,转化,获得的双分子阳性克隆命名为:pBAD-ScFv_6D7C9-HPV16 E7,通过Western Blot分析及间接血凝试验检测表达产物的双特异功能,即其与HPV16 E7抗体和RBC同时结合,并通过血凝反应检测HPV16 E7抗体的能力。2.3 Rh（D）抗原Fab抗体的制备收集5份血清中抗Rh（D）效价在1:256-512之间的人淋巴细胞,提取RNA,用多对引物PCR分别扩增其VH、Vκ、Vλ基因,同时,分别从pComb3xTT和pComb3xλ噬粒中扩增CH1、C_κ、C_λ,通过重叠PCR,构建重链的Fd基因及完整的kappa、Lamda轻链,并进一步重叠PCR,获得Fab抗体片段。Fab经酶切、连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS中,构建获得抗Rh（D）的Fab抗体库,经四轮Rh（-）/ Rh（+）红细胞阴/阳淘筛,获得的阳性克隆分别进行血凝试验、western blot分析及测序鉴定。3结果3.1红细胞血型单克隆抗体的制备3.1.1 MNSs血型系统mAbs获得的8种杂交瘤细胞株中,其中4株作用于GPA的M表位、1株作用于GPA的N表位; 3株为同时抗GPA和GPB蛋白的GPA/GPB mAbs。杂交瘤细胞培养上清效价介于1×2^-4–1×2^-8之间,腹水mAbs效价在1×2^-7–1×2^-12之间。除1株mAb,1C1C9C4为IgM外,其他7株mAbs均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAbs抗原表位检测,确定4株、1株mAbs可分别特异性结合于GPA的M、N表位;另3株mAbs,6D7C9、7C9H4和7C9G11,与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,它们为抗GPA/GPB mAbs。3.1.2 Ii血型mAbs获得了3个抗i的mAbs:A10G5F9E2E7、A11G5F9E2C4和A10G2。杂交瘤细胞培养上清效价介于1×2^-1–1×2^-4之间,其中A10G5F9E2E7的腹水效价在1×2^-10–1×2^-11之间。三株mAbs均为IgG3型。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞（含胎儿i血型、成人I血型及成人稀有i血型）的反应格局,确定这3株mAbs特异性结合i抗原。3.1.3 Kell血型系统的mAbs获得3个抗Kell的mAbs:4H2A8、2F9F5和4D10G11,杂交瘤细胞培养上清效价介于1×2^-5–1×2^-10之间,抗体亚型检测均为IgG1。通过杂交瘤细胞培养上清与Kell蛋白原核表达多肽Kell-30c（kell蛋白C末断的30个氨基酸）的ELISA检测,确定这3株mAbs特异性结合Kell抗原。3.2 ScFv_6D7C9-HPV16 E7双功能分子的制备ScFv_6D7C9测序结果表明:VH隶属小鼠Ig重链第II亚组,而VL隶属小鼠Ig Kappa链IV亚组。Western blot分析显示:在相对分子质量33 000处有ScFv目的蛋白表达（与c-myc融合）,血凝试验证明该表达产物有红细胞凝集活性。在此基础上构建的pBAD-ScFv_6D7C9-HPV16 E7双功能表达载体,经诱导表达后, Western Blot分析发现在相对分子质量50 000处有目的蛋白条带。而含双功能蛋白的细菌培养上清加入HPV16 E7抗体（病人血清）及RBC后,未观察到明显的血凝现象。3.3 Rh（D）抗原Fab抗体的制备构建获得总库容为7.4×106的Fab抗体库。经四轮Rh（-）/ Rh（+）红细胞阴/阳淘筛,获得了2株能与Rh（+）红细胞特异凝集,而与Rh（-）红细胞不凝的阳性克隆,Western blot表明所获抗体能特异结合红细胞上的Rh抗原。DNA序列分析表明:所获2株阳性克隆的序列相同,VH属VH3-23亚群家族,V_κ属V_κⅢ亚群Ⅸ家族。4结论4.1单克隆抗体1)获得了5株抗GPA的mAbs2)获得了3株作用于GPA/GPB的mAbs3)获得了3株抗i抗原的mAbs4)获得了3株抗kell抗原的mAbs4.2基因工程抗体1)构建的ScFv_6D7C9有红细胞凝集活性2) ScFv_6D7C9-HPV（E7）双功能蛋白能融合表达,但未通过血凝反应检测到血清中的HPV16 E7抗体3)获得有红细胞凝集活性的特异性抗Rh（D）的Fab抗体