siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901VEGF基因表达的影响

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目的利用siRNA(small interferference RNA)抑制VEGF基因表达对人胃腺癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影响。方法(1)体外转录siRNA:选择血管内皮生长因子(VEGF)基因为靶基因,设计针对VEGFmRNA的小干扰RNA,合成DNA寡核苷酸,体外转录合成siRNh。(2)将siRNA转染入靶细胞:以8GC-7901人胃腺癌细胞系为靶细胞,使用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞。(3)观察转染后癌细胞的变化:MTT法检测细胞存活率,Hoechst33258染色观察siRNA作用细胞后出现凋亡小体的情况,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR检测转染后VEGFmRNA表达水平的变化,ELISA检测VEGF蛋白表达的下降效果。结果(1)体外转录的针对VEGFmRNA两个靶位点的siRNA经脂质体转染入肿瘤细胞后均能有效抑制肿瘤细胞的生长,而作为阴性对照组的错义序列siRNA完全不起作用。(2)转染后24小时用MTT法检测各组SGC-7901细胞代谢率的统计结果显示:低、中、高剂量组的MTT代谢率明显低于正常对照组,与错义对照组(即siRNASCR组)比较有高度统计学意义(P<0.01);极高剂量组的MTT代谢率也低于错义对照组,其与错义对照组比较有统计学意义(P<0.05)。错义序列组、脂质体组与正常对照组比较没有显著差异(P>0.05)。(3)Hoechst33258染色观察:转染siRNA 48h后,荧光显微镜下观察到细胞核染色质高度凝聚,并裂解成碎块,产生凋亡小体。(4)流式细胞仪检测到siRNA作用的细胞G0/G1期(细胞静止期和DNA合成前期)比例升高,S期和G2/M期(DNA合成期与有丝分裂期)比例降低,错义序列组、脂质体组无此变化;(5)转染后24小时siRNA1和siRNA2组的RT-PCR结果显示其VEGF mRNA表达量明显下降。(6)转染后24小时后,siRNA1和siRNA2组的VEGF分泌含量也明显显著降低,然而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有这种效果,不起作用。结论(1)应用生物软件所设计出来的针对两个靶位点的siRNA均能有效抑制VEGF蛋白的表达和细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,改变细胞周期,为肿瘤的基因治疗提供了新思路。(2)在胃腺癌的抗血管生成基因治疗中VEGF是有效的靶位点。(3)RNAi能够成功应用于体外培养的胃腺癌细胞系作为基因治疗肿瘤的临床前试验,有可能成为未来肿瘤基因治疗的生物类新兴药物。
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