昆虫的性别决定与分化是种族能够繁衍和延续的物质基础。课题组在前期工作中发现在果蝇（Drosophila melanogaster）性别决定信号通路基因附近存在大量的核仁小RNA（small nucleolar RNA,snoRNA）,干涉其中一个snoR3会造成性别决定信号通路基因Transformer（Tra）内含子出现滞留,暗示snoR3可能参与果蝇性别决定的调控。本研究以果蝇为研究对象,首先通过荧光原位杂交研究snoR3在果蝇细胞核质中的定位及在不同细胞周期下核质中的迁移变化。其次在果蝇Kc细胞系中干涉snoR3,转录组测序研究其对全基因组基因选择性剪接的影响。最后在细胞系中干涉及过表达snoR3,验证其对剪接体蛋白基因FBtr0302294和FBtr0331375表达量的影响及对性别决定信号通路基因选择性剪接的影响,探索snoRNA在性别决定中的调控作用。同时在细胞中干涉剪接体蛋白基因FBtr0331375,检测其对果蝇性别决定信号通路基因选择性剪接的影响,探索其参与果蝇性别决定的调控机制。主要研究结果如下:1.snoR3在果蝇细胞核质中的定位及在不同细胞周期下核质中的动态变化。使用Cy3标记的荧光探针,原位杂交检测snoR3在细胞中的分布情况,结果表明,核仁小RNA snoR3在细胞核与细胞质中均存在,且在胞质中含量较高,在细胞核中主要位于核仁部位。snoR3的分布随细胞周期而变化,在分裂间期snoR3在细胞质和细胞核中均存在,在胞质中分布较广,在细胞核中主要聚集在核仁区。到分裂前期,核仁解体,此时snoR3在胞质中积累较多。到分裂中期,snoR3在细胞中表达量降至最低,此时主要存在于细胞质中;至分裂后期,姐妹染色单体逐渐移向两极,此时snoR3在细胞质中逐渐增加,环绕染色体周围分布;到分裂末期子细胞形成,snoR3重新分布在细胞质和细胞核核仁中。表明snoR3的表达随着细胞分裂周期的进展不断发生变化,其主要作用部位在核仁和细胞质中。2.紫外胁迫下snoR3的核质分布情况。真核细胞遭遇外界逆境会进入核仁应激状态,同时核仁小RNA会从细胞核迁移到细胞质中响应逆境。我们选择果蝇Kc细胞,使用不同剂量的用紫外线处理细胞6 h,通过原位杂交技术鉴定核仁小RNA snoR3在Kc细胞中是否存在穿梭现象。结果表明,随着紫外线处理剂量的增加,snoR3在细胞质中的荧光信号逐渐增强,且在胞质某些部位出现聚集,表明snoR3响应紫外线的逆境响应,但其核质迁移现象不明显。3.转录组测序检测干涉snoR3后全基因组水平基因选择性剪接的变化。使用反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide,ASO）在Kc细胞中干涉snoR3表达,转录组测序检测其对细胞中基因表达及选择性剪接的影响。使用DNBSEQ平台测了CK、NC、snoR3-ASO1（ASO1设计在snoR3第28-47个核苷酸位置）和snoR3-ASO2（ASO2设计在snoR3第48-67个核苷酸位置）4个样品,每个样品3个重复,共计12个样品的转录组数据。平均测得6.43Gb的数据量,与基因组上的基因进行比对平均比对率为78.88%,unique基因比对率为66.05%。与已知基因进行比对检测到表达的基因数为14,473个,其中已知的基因为13,931个,预测的新基因为541个。对干涉snoR3后差异表达的基因进行分析发现,在snoR3-ASO1和ASO2中同时出现差异表达的基因共计1253个,GO分析发现差异表达的基因多在膜及膜功能相关的基因信号通路中,KEGG分析发现差异表达的基因大多聚集在固醇类合成、蛋白吸收与降解及溶酶体信号通路上,表明snoR3被干涉后,与膜功能及蛋白代谢相关的基因发生了较大的变化。对这1253个基因进行蛋白网络分析发现有14个位于网络中央的基因,他们之间相互作用,其中有10个功能未知的unknown-protein基因,但它们大多在雄性和精巢组织中高表达。另外4个基因分别为:FBgn0259794:sinah,E3泛素连接酶1（E3 ubiquitin protein ligase 1）;FBgn0051025:蛋白磷酸酶1c互作蛋白1（Protein phosphatase 1c interacting protein 1）;FBgn0032003:胞苷脱氨酶（Cytidine deaminase）;FBgn0035143:丝/苏氨酸磷酸酶1（Ppm1,Protein-serine/threonine phosphatase）,它们均在testis、male中高表达。这些蛋白大多参与蛋白的加工、修饰和降解,表明干涉snoR3后差异表达的蛋白核心功能在蛋白的代谢上。用r MATS检测样品的可变剪接,发现使用ASO1干涉后内含子滞留的基因有54个,使用ASO2干涉后内含子滞留的基因有26个。GO分析发现这些基因多集中在protein binding基因上,KEGG分析发现它们多集中在嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）的代谢过程上。表明出现内含子滞留的基因多参与了核酸的代谢过程。对这些基因进行蛋白网络分析发现有四个基因FBgn0020622、FBgn0259246、FBgn0260632和FBgn0262582聚集在一个信号网络上。FBgn0259246能够编码细胞骨架蛋白,在头和神经高表达;FBgn0260632编码在转录因子,在Toll信号通路的下游,对早期胚胎背腹侧形成具有关键作用,在卵巢高表达;FBgn0262582编码一个HMG-box family转录抑制因子,在神经和卵巢高表达。表明干涉snoR3可通过造成基因内含子滞留对基因的转录、蛋白与核酸代谢产生影响。4.干涉snoR3对剪接因子FBtr0302294和FBtr0331375以及性别决定信号通路基因的影响。转录组测序获得FBtr0302294和FBtr0331375两个可变剪接因子基因出现表达量明显变化,FBtr0302294为Pcf11RD,是裂解和聚腺苷酸化因子IA（cleaved and polyadenylation factor IA,CFIA）,参与pre-mRNA 3’端的加工和转录终止。FBtr0331375为sn RNP-U1-70K-RC,小核糖核蛋白颗粒U1亚基70K（sn RNP-U1-70K）编码U1 sn RNP的一个蛋白质组分。为进一步验证干涉snoR3后这些剪接因子相关基因哪些区段发生了可变剪接,使用ASO在Kc细胞中干涉snoR3表达,PCR检测剪接位点的变化,结果表明干涉snoR3后剪接因子FBtr0302294第一内含子滞留现象被缓解,FBtr0331375的选择性剪接形式无显著变化。qPCR检测基因FBtr0302294和FBtr0331375的表达量,发现FBtr0331375的表达水平上升至对照NC对照的3.28倍,差异极显著,FBtr0302294的表达水平与NC相比上调了77.2%。干涉snoR3后性别决定基因sxl和tra的内含子滞留,pre-mRNA出现,雌性细胞系Kc中雄性剪接体sxl M增加,tra的雄性剪接体tra M消失;tra的成熟mRNA表达量与NC相比下降了22%,sxl的成熟mRNA表达量没有显著变化。5.过表达snoR3后剪接因子FBtr0302294和FBtr0331375以及性别决定信号通路基因的变化。构建snoR3过表达载体转染Kc细胞,qPCR检测剪接因子基因及性别决定信号通路基因的变化。结果显示,过表达snoR3后,FBtr0302294成熟mRNA表达水平与对照相比上调101%;FBtr0331375表达水平与对照相比上调117%;过表达snoR3后FBtr0302294、FBtr0331375的可变剪接形式没有明显变化。qPCR检测过表达snoR3后性别决定信号通路基因sxl、tra的变化,结果显示过表达snoR3后tra的成熟mRNA表达量是对照的4.6倍,sxl成熟mRNA无显著变化,二者的选择性剪接形式也无明显改变。6.干涉剪接因子基因对果蝇性别决定信号通路基因的影响。用T7体外转录的方法合成基因FBtr0302294和FBtr0331375的ds RNA,转染Kc细胞,结果发现ds RNA有效干涉了FBtr0331375的表达,FBtr0331375的表达量与对照相比下降了66%,差异显著。PCR检测干涉FBtr0331375后性别决定信号通路基因sxl、tra的变化,Kc中sxl的雌剪接体sxl F表达量上升。本文系统研究了核仁小RNA snoR3在雌性细胞系Kc中的定位及细胞周期变化,及其对逆境的响应,发现snoR3不仅在核仁中存在,同时在细胞质中大量表达,其随细胞周期呈现周期性核质分布。在Kc细胞中干涉snoR3,转录组测序发现,干涉snoR3后参与精巢蛋白加工、修饰和降解的基因出现显著差异表达,出现可变剪接变化显著的形式是内含子滞留,且这些基因多参与了嘌呤和嘧啶核酸的代谢过程,其中两个剪接因子蛋白基因FBtr0331375（CFIA）和FBtr0302294（sn RNP-U1-70K-RC）变化显著,表明干涉snoR3可能通过剪接因子相关基因影响细胞中其他基因的可变剪接。Kc细胞中干涉和过表达snoR3,发现干涉snoR3后FBtr0331375、FBtr0302294的成熟mRNA表达升高,性别决定信号通路基因sxl和tra的内含子滞留pre-mRNA出现,sxl的雌性剪接体sxl M增加,tra的雄性剪接体tra M消失,tra的成熟mRNA表达量降低。综上所述,snoR3影响性别决定通路基因的可变剪接,干涉snoR3造成性别决定基因sxl和tra内含子滞留,但其是否通过对剪接因子的调控来参与性别决定仍需进一步的研究。该研究首次发现核仁小RNA参与果蝇性别决定信号通路基因的选择性剪接,为mRNA加工过程引入了新的调控因子,为研究昆虫性别决定提供了新的思路,为害虫防治研究提供了新的靶点。