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背景和目的骨肉瘤（osteosarcoma）又称成骨肉瘤,由肉瘤性成骨细胞及其直接产生的骨样组织、新生骨构成。是原发性恶性骨肿瘤中最常见,恶性程度最高的骨肿瘤。骨肉瘤临床以15-25岁发病者居多。70%以上的病人发生在股骨远端和胫骨近端、肱骨近端的干骺端。骨肿瘤发展快、转移早、预后差,以往单纯手术治疗5年生存率不超过20%。骨肉瘤确切的发病机制尚未明晰,但随着肿瘤分子生物学的研究不断进展,已经发现骨肉瘤的发生发展与p53、MDM2等一些基因突变和表达水平密切相关。人类的癌症约有一半是由于TP53基因（编码转录因子p53）的突变或缺失而引起的。p53蛋白在抑制癌症中具有重要的作用。p53的活性受到负调节蛋白MDM2（murine double minute 2,MDM2）的反馈抑制性调节。MDM2在许多肿瘤中过度表达,它和p53蛋白结合,通过调节p53转录子的活性和稳定性来抑制p53的功能。通过抑制p53和MDM2的结合,激活p53活性,已经成为抗肿瘤药物开发的热点。然而,针对MDM2非肽抑制剂药物的研制是一个巨大的挑战,虽然寻找到了一些MDM2抑制剂,但目前的抗肿瘤实验结果都不够理想。为此,本实验利用RNA干扰技进行一些初步的探索。本研究利用分子生物学技术,构建MDM2靶向基因的siRNA载体,转染到人骨肉瘤细胞株U-20S内,检测U-20S细胞中MDM2基因表达的沉默作用,同时观察MDM2基因表达抑制后对人骨肉瘤细胞株U-20S细胞生长和凋亡的影响。实验方法利用Promega和Ambion的siRNA靶序列分析设计软件,分析人MDM2cDNA编码序列（NM002392）,依据siRNA靶序列设计原则,应用BLAST同源性分析,确定siRNA靶序列。合成3对MDM2基因靶向siRNA序列的DNA单链,退火成双链DNA,用BamHI和HindⅢ双酶切pSilencer2.1制备线形双粘siRNA载体;将退火的发卡样siRNA片段重组入pSilencer2.1;利用BamHI和HindⅢ双酶切筛选得到重组子pSilencer2.1-MDM2si373、pSilencer2.1-MDM2si646和pSilencer2.1-MDM2si946;对重组子的插入序列进行DNA序列测定,并与设计序列做同源性比较。将pSilencer2.1-MDM2si373、pSilencer2.1-MDM2si646和pSilencer2.1-MDM2si946转入人骨肉瘤U-20S细胞中,同时设空载体对照组（转染空载体pSilencer2.1）和空白对照组（未转染人骨肉瘤U-20S细胞）;RT-PCR和Westem-Blot方法检测各组细胞MDM2 mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术和MTT法检测各组细胞的细胞生长和凋亡情况。实验结果1.初步筛选出58个候选siRNA靶区段,候选序列又经过进一步的同源序列检索和优选,最后确定（NM002392）373-391位（CAAGAGACCC UGGUUAGAC）、646-664位（UCAUCGGACUCAGGUACAU）和946-964位（UCUACAGGGACGCCAUCGA）为靶序列。2.BamHI和HindⅢ双酶切筛选得到重组子pSilencer2.1-MDM2si373、pSilencer2.1-MDM2si646和pSilencer2.1-MDM2si946,测序分析其插入序列与设计完全一致。3.实验1、2、3组（转染pSilencer2.1-MDM2si373、转染pSilencer2.1-MDM2si646、转染pSilencer2.1-MDM2si946）细胞MDM2 mRNA的相对表达量分别为0.12±0.02、0.21±0.03、0.27±0.03;空载体对照组和空白对照组细胞MDM2mRNA的相对表达量分别为0.78±0.11和0.82±0.13。实验1、2、3组细胞MDM2mRNA的相对表达量与2个对照组相比,MDM2 mRNA的相对表达量显著降低,统计学分析差异有显著性（P＜0.05）。4.在约为90kD处,空白对照组和空载体对照组可见染色较深的明显MDM2蛹?实验1、2、3组在90kD处也有MDM2印迹,但染色明显浅于两个对照组。其中实验1、2组染色最浅。说明3个MDM2基因沉默组均可有效抑制细胞MDM2蛋白的表达。5.3个实验组细胞在3d、4d生长显著受到抑制,与2个对照组细胞MTT测定结果比较差异均有显著性（P＜0.05）。6.实验1、2、3组的细胞凋亡率分别为14.6%±2.1%、13.9%±2.6%、10.3%±1.9%;空载体对照组和空白对照组的细胞凋亡率分别为5.7%±0.8%和4.6%±0.9%。实验1、2、3组与2个对照组相比,细胞凋亡率显著增加,统计学分析差异有显著性（P＜0.05）。结论1.MDM2基因（NM002392）373-391位（CAAGAGACCCUGGUUAGAC）和646-664位（UCAUCGGACUCAGGUACAU）为靶区段,构建的siRNA载体pSilencer2.1-MDM2si373和pSilencer2.1-MDM2si646,转染人骨肉瘤U-20S细胞能显著降低细胞MDM2基因的表达,是比较理想的siRNA靶区段。2.RNAi干扰人骨肉瘤U-20S细胞MDM2基因的表达,对人骨肉瘤U-20S细胞的生长有抑制作用,同时可增加细胞凋亡。