论文部分内容阅读
由于量子点(quantum dots,QDs)具有荧光效率高、稳定性高、Stockes位移较大、发射光谱窄而对称、单一波长多色激发等诸多优秀的荧光特性,因此量子点可作为新型荧光标记材料。通过与传统酶联免疫吸附法(ELISA)结合来构建新型的量子点荧光免疫吸附法(QD-FLISA,简称QLISA),这种方法可以克服ELISA操作繁琐及结果易受酶活性和底物稳定性的问题,在实现高灵敏、多指标检测的同时,且无需显色操作,方便快捷,可在较长时间内多次激发仍能保持检测信号的稳定。但作为一种新型的检测技术,在实际应用过程中仍然存在一些问题,如检测灵敏度及结果准确度尚未达到临床应用标准。在实际样本检测时,人的血液等体液样本具有复杂性,不可避免的存在一些常见金属离子。而在以往的研究中发现一些金属离子对量子点有荧光猝灭现象,并利用其猝灭的原理发展了金属离子传感器以实现对金属离子的高灵敏定量检测。这些体液中常见的金属离子对量子点的荧光信号会产生何种影响,这将会进一步影响QLISA方法对准确可靠的检测结果的获得。因此,探究这些金属离子对水相量子点及其QLISA检测方法的影响具有十分重要的意义,而且目前尚未见过有研究者们开展过相关的研究工作。因此,本论文以探究不同金属离子对水相量子点的具体作用及结合这一作用在QLISA中的应用,发现了一种有效利用金属离子增强荧光的免疫吸附法(金属离子-QLISA)。(1)不同金属离子对水相量子点的作用。我们用三种水相量子点的传统合成方法成功将红色的CdSe/ZnS油溶性量子点改性成三种具有不同表面配体的水溶性量子点:3-巯基丙酸修饰的量子点(QDs@MPA)、二氧化硅包覆的量子点(QDs@SiO2)、聚合物包覆的量子点(QDs@PMAH)。随后,将 Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+和Ag+等九种金属离子分别加入三种水相量子点中,发现Ca2+、Mg2+、Ba2+均不会猝灭三种水相量子点的荧光;Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+在加入一定量时,会猝灭三种水相量子点荧光;Cu2+、Ag+的加入可以完全猝灭三种水相量子点的荧光。选取Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+、Cu2+五种金属离子加入三种水相量子点中,对其水合粒径的变化进行探究,发现在各金属离子加入不同量时,均会使三种水溶性量子点水合粒径增大,随着离子加入量的逐渐增多,三种水相量子点都会发生团聚并沉淀。紧接着发现在25℃～45℃范围内,在三种水相量子点中加入一定浓度的五种金属离子时,其形成的荧光复合物均可保持水合粒径及电位的稳定。(2)金属离子对基于量子点构建的QLISA方法的影响。在原QLISA方法的荧光探针QD-mAb中加入一定量金属离子以构建金属离子-量子点探针(金属离子-QD-mAb),并优化荧光探针中不同金属离子的浓度。优化金属离子-QLISA方法的反应体系,确定了以磷酸盐缓冲液(PBS)+小牛血清为最佳反应体系,随后选取Ca2+-QLISA方法进行反应时间的优化,最终在最佳优化条件下对炎症因子C-反应蛋白(CRP)进行多种金属离子-QLISA方法的定量检测。实验结果发现:以QDs@SiO2为荧光标记物的 Mg2+-QLISA、Ca2+-QLISA 和 Fe2+-QLISA 检测 500 ng/mL CRP 的荧光信号分别为原始QLISA的3.2倍、3.9倍和3.5倍,相应的灵敏度分别为原始QLISA的5.6倍、4.2倍和1.6倍;Ba2+-QLISA和Mn2+-QLISA检测CRP的荧光信号分别为原始QLISA的2.8倍和1.3倍,但灵敏度未提高。以QDs@PMAH和QDs@MPA为荧光标记物的金属离子-QLISA检测500 ng/mL CRP的荧光信号也较QLISA有所增强。且将合适浓度的三价金属离子Fe3+和A13+引入QLISA,也具有荧光信号增强的效果。在金属离子-QLISA方法中加入的这些金属离子浓度远大于体液中的金属离子浓度,即体液中的金属离子不会对QLISA结果产生影响,而添加合适浓度的金属离子(Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Mn2+、Fe3+、Al3+)不仅没有猝灭量子点的荧光,反而提高了 QLISA检测的荧光信号,尤其是Mg2+、Ca2+和Fe2+的加入可以提高QLISA检测的灵敏度。此外,运用金属离子-QLISA方法对同类的炎症因子(血清淀粉样蛋白A(SAA)和降钙素原(PCT))进行检测,荧光信号也得到了有效提高。由此我们建立了添加合适浓度的多价金属离子增强QLISA荧光信号的新型金属离子-QLISA,且这种方法操作简单,具有较好的通用性。