PRL-3与PRL-3(+)/APC(min/+)转基因小鼠模型的建立及鉴定

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiner1312
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研究背景和目的结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤,其发病率已位居恶性肿瘤谱的第四位,在全球其发病率居恶性肿瘤的第三位,且呈继续上升趋势。转移是导致结直肠癌患者治疗失败及死亡的重要原因。多数患者在行根治手术前已出现了微转移,它们是结直肠癌术后复发与转移的直接原因。因此,寻找结直肠癌早期诊断的特异性分子标志物,筛查转移相关基因,阐明转移机制,为临床抗转移治疗提供理想的药物靶点是当前结直肠癌研究的重点。PRL-3又称PTP4A3,是新近发现的一种与肿瘤转移相关的基因,编码一类分子量较小的酪氨酸磷酸酶,是现已发现与结直肠癌转移相关的少数特异性表达分子之一。2001年,Saha等在《Science》上发表了PRL-3与结直肠癌转移相关的报道,首次将PRL-3与人类恶性肿瘤联系在一起,PRL-3作为一种酶在结直肠癌肝转移细胞内高度表达,是药物治疗的理想靶点。目前,大量体内外实验表明PRL-3高表达可促进细胞的生长、浸润、迁移、恶性转化和癌性转移,对肿瘤血管的形成也起到重要作用。但是,PRL-3在肿瘤转移中的具体作用机制及信号通路仍不清楚。本课题组前期研究也表明PRL-3表达与结直肠癌转移密切相关,并应用酵母双杂交技术发现了PRL-3新型相互作用蛋白CDH22(钙粘附蛋白家族成员),进而研究了PRL-3对结直肠癌钙粘附蛋白相关信号通路的调节作用。然而,肿瘤转移是一个复杂的、多步骤、多基因参与的体内过程,会受到活体内众多因素的调控。因此,为进一步研究PRL-3在肿瘤转移中的具体作用机制,并从整体上确定PRL-3基因在结直肠癌转移中的作用,本课题拟构建PRL-3转基因动物模型,活体内进行研究。通过受精卵原核雄注射技术,我们构建了PRL-3转基因小鼠模型,并通过与自发肠道腺瘤的APC(min/+)鼠杂交,建立了PRL-3(+)/APC(min/+)转基因小鼠模型;对两种转基因小鼠模型进行了详细的鉴定与表型分析;成功构建的两种转基因小鼠模型,不仅可用于PRL-3体内功能的研究,还可作为抗肿瘤药物研究的活体靶点,旨在将来能发展成与结直肠癌发生发展规律相一致的自发肿瘤转移转基因小鼠模型。方法1.肠特异性启动子mA33驱动的人PRL-3载体的构建与鉴定选择小鼠肠特异性表达A33启动子(mA33),利用重叠延伸PCR技术将启动子与目的基因人PRL-3全长cDNA(去除终止码TAG)进行无缝连接,再通过基因载体克隆技术构建pEGFP-N1-mA33-PRL-3真核表达载体,应用酶切、PCR、测序等方法进行鉴定。2.受精卵雄原核显微注射技术建立PRL-3转基因小鼠模型酶切pEGFP-N 1-mA33-PRL-3,取进行注射的大小为2.4 kb目的片段回收纯化,稀释成2ng/μl的注射用DNA溶液;按标准程序准备受精卵供体母鼠、种公鼠、结扎公鼠和假孕母鼠;取单细胞期受精卵进行雄原核显微注射,移植进假孕母鼠输卵管内,制备FO代转基因小鼠。经2次重复PCR初步鉴定阳性转基因首建鼠。3.PRL-3转基因小鼠模型的繁殖传代与鉴定将PCR阳性的转基因小鼠与野生型C57BL/6J小鼠进行交配繁殖。首建鼠各自建系,获得的仔鼠,首先全部进行整体荧光成像仪检测、双引物PCR检测以初筛;再分组进行组织病理学观察、免疫组织化学检测、冰冻切片荧光显微镜EGFP检测、冰冻切片免疫荧光共定位检测及Western blot检测及鉴定。对转基因小鼠DNA水平的整合情况,蛋白水平PRL-3、EGFP的表达情况以及繁殖传代情况进行详细记录。4.PRL-3转基因小鼠模型的遗传稳定性与表型分析整理各系转基因小鼠繁殖传代情况与阳性率,分析转基因小鼠模型的遗传稳定性;密切观察转基因小鼠后代的身体形态、生活习性、生长发育以及毛发、体重、生殖能力等,结合组织病理学检测结果进行表型分析。5. APC(min/+)小鼠的繁殖与鉴定APC(min/+)阳性雄鼠与同窝阴性野生型雌鼠进行交配繁殖,仔鼠用PCR方法筛选,同样密切观察阳性鼠。分期(1m、3m、4m)乙醚安乐处死APC(min/+)突变鼠与野生型小鼠,每组6只,雌雄各半,称重,比较两种小鼠生长发育情况及体重增长情况。结合大体与组织病理学观察各期胃肠腺瘤形成与发展情况,Image-Pro Plus (IPP) 5.0图像处理分析软件测量腺瘤大小(测量最长径)并计数。6. PRL-3(+)/APC(min/+)转基因小鼠模型的建立、鉴定及表型分析将PRL-3阳性转基因小鼠与APC(min/+)阳性小鼠进行杂交,PCR方法筛选PRL-3与APC双阳性小鼠为PRL-3(+)/APC(min/+)转基因小鼠。同样密切观察阳性鼠,分别处死1m、3m的PRL-3(+)、APC(min/+)、PRL-3(+)/APC(min/+)及Wild四种小鼠,每组6只,雌雄各半,称重。比较1m各小鼠生长发育及体重情况,结合大体与组织病理学检测其胃肠肿瘤形成与发展情况,Image-Pro Plus(IPP)5.0图像处理分析软件测量肿瘤大小(测量最长径)并计数。7.统计学方法实验数据采用SPSS 13.0软件包进行统计:各小鼠体重比较采用析因设计的方差分析、单因素方差分析及两独立样本T检验;各小鼠肠道腺瘤大小比较采用两独立样本T检验。结果1.成功构建肠特异性启动子mA33驱动的人PRL-3载体通过重叠PCR与基因克隆技术成功构建EGFP-N1-mA33-PRL-3载体,酶切、PCR、测序比对结果完全正确。最终酶切得到的DNA原核显微注射片段为:转录保护序列—mA33启动子—PRL-3目的基因—EGFP绿色荧光蛋白—SV40polyA转录终止子,总大小为2.4 kb。mA33启动子与PRL-3目的基因间是无缝连接,而PRL-3目的基因与EGFP绿色荧光蛋白则通过酶切位点连接形成融合蛋白。整个注射片段设计合理、大小合适,连接正确。2.成功制备PRL-3转基因首建鼠通过受精卵原核显微注射,共获得47只转基因小鼠,经两次PCR重复检测,鉴定出5只为PRL-3整合阳性鼠,转基因阳性率为10.64%。3.成功建立PRL-3转基因小鼠模型5只PRL-3转基因首建鼠各自建系繁殖,其中2只得到有效繁殖(已经获得F3代小鼠)并获得绿色荧光蛋白表达的PRL-3转基因小鼠。双引物PCR检测结果表明外源转入目的基因在小鼠体内DNA水平整合完整;免疫组化、免疫荧光共聚焦检测结果显示EGFP与PRL-3蛋白定位一致;Western-blotting结果证明EGFP与PRL-3形成融合蛋白。结果表明得到可视化特性的PRL-3转基因小鼠,阳性表达部位主要在脑、肠、心、肺、肾、胰等部位。可视化PRL-3转基因小鼠的建立不但可以作为PRL-3活体内功能研究的理想动物模型,而且将来还可用于抗肿瘤药物的制备及筛选。4.PRL-3转基因小鼠模型的遗传稳定性与表型分析PCR检测PRL-3转基因小鼠后代外源基因的出现频率接近50%,符合孟德尔遗传规律,转基因鼠获得稳定遗传。对4代转基因小鼠的连续观察发现:雄性阳性比例显著高于雌性;雄性小鼠在外形、生长发育(P>0.05)及繁育方面与野生型小鼠无明显差异,但雌性小鼠较野生型小鼠生长发育缓慢(P<0.05)、性情温顺懒惰、生殖繁育及遗传能力明显降低。表明PRL-3基因的导入对雌性小鼠的生长发育繁殖有明显影响,但在雄性小鼠可获得稳定遗传。PRL-3转基因小鼠模型,肠特异性启动子并没发挥理想的作用,但PRL-3表达广泛增强。目前出现肠道、腹腔淋巴结增生活跃,血管增生明显等特点;一只首建鼠(38♀)出现了头颈部肿瘤,尚未死亡,继续观察肿瘤发生发展情况,待后鉴定。5. APC(min/+)小鼠的生长进程与肠道自发腺瘤的检测鉴定连续观察,APC(min/+)小鼠生长发育较野生型小鼠迟缓(P<0.05),2月大小开始出现血便,3月龄可出现脱肛、持续血便、腹水等现象,4月龄呈濒死状态,体重明显轻于野生型小鼠(P<0.05),对刺激无反应,心跳缓慢,呼吸微弱,四趾苍白明显贫血状态。总生存时间为120天左右。APC(min/+)小鼠肠道自发腺瘤呈进行性生长,其小肠腺瘤发生早(<1月)、数目多(20-50个)、体积较大(0.6~5.5mm);大肠腺瘤发生较晚(>1月)、数目少(1-5个)、体积略小(1.2~4.2mm)。6. PRL-3(+)/APC(min/+)转基因小鼠模型的建立及鉴定PRL-3转基因小鼠与APC(min/+)小鼠杂交,得到PRL-3、APC(min/+)、PRL-3 (+)/APC(min/+)与野生型四种小鼠。将它们体重进行比较,PRL-3、APC(min/+)与PRL-3(+)/APC(min/+)三种小鼠生长发育均较野生型小鼠迟缓(P<0.05);而PRL-3、APC(min/+)与PRL-3(+)/APC(min/+)三组小鼠间两两比较则无明显差异(P>0.05)。得到的PRL-3(+)/APC(min/+)小鼠有皮肤粗糙、毛发不全、生长迟缓等外型特点;与APC(min/+)小鼠比较,其大小肠腺瘤发生数目增多(P<0.05),并且结直肠出现多个异型明显、具有恶变趋势的微小腺瘤。结论1.成功构建重组质粒pEGFP-N1-mA33-PRL-3,为结直肠癌及PRL-3功能研究提供了优质的三基因整合载体。2.成功建立可视化的PRL-3转基因小鼠模型,并得到稳定遗传,为体内研究PRL-3功能及作用机制提供了理想的动物模型。3.PRL-3表达增强促进血管与淋巴结增生。4.PRL-3基因的转入影响雌性小鼠的生长发育繁殖,雄性阳性率明显高于雌性。5.将PRL-3转基因小鼠与APC(min/+)小鼠杂交,获得的PRL-3(+)/APC(min/+)小鼠出现皮肤粗糙、毛发不全、生长迟缓等特点;组织学特点主要表现为肠道腺瘤数目增多,结直肠出现局灶性微小腺瘤样增生,其肿瘤细胞出现明显异型,具有恶变趋势。展望1.PRL-3转基因小鼠体内PRL-3有可视化的广泛高表达,能够进行连续的活体内无损伤动态检测,将会是抗肿瘤靶基因治疗的理想动物模型;2.继续跟踪观察PRL-3转基因38早首建鼠出现的颈部肿瘤,观察PRL-3转基因小鼠模型经长期培养、大量繁育、不断筛选后,是否可获得稳定的自发肿瘤种系;3. PRL-3(+)/APC(min/+)小鼠由于APC基因的突变再加上PRL-3基因过表达,目前出现了明显异型、具有恶变趋势的结直肠微小腺瘤,长期培养有望发展成为与结直肠癌发生发展规律相一致的自发肿瘤转移转基因小鼠模型。
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