内质网是真核细胞中负责蛋白折叠和装配的场所,对细胞内的蛋白质稳态平衡非常重要。内质网应激是由于Ca2+稳态平衡的紊乱、分泌蛋白合成的增加、错误折叠蛋白质的表达、葡萄糖饥饿、蛋白质糖基化的抑制或胆固醇合成超载等胁迫条件,干扰蛋白质的合成,导致内质网内积累大量的未折叠蛋白质,细胞所做出的应激反应,主要激发包括PERK-elF2α,IRE1α-XBP1及ATF6等3条未折叠蛋白反应(UPR)信号通路,通过激活CHOP、ATF4、XBP1以及ATF6等多个b-zip转录因子活性,调控相关基因的表达调控。肌醇需求酶-1(inositol-requiring enzyme-1α, IRE-lα)是最保守的UPR信号通路感应器,单次跨膜定位在内质网膜上,具备丝氨酸/苏氨酸激酶和核酸酶双重功能。IRE1α通过剪切底物XBP1mRNA,激活一系列UPR相关基因的转录,从而缓解内质网压力；IRE1还可以通过不依赖XBP1的途径,激活JNK (c-junk N-terminal kinase),引发细胞的凋亡。IRE1α-XBP1通路参与众多病理和生理过程：IRElα激酶促进突变性亨廷顿蛋白的聚集,从而加剧亨廷顿综合症；IRE1α是肿瘤血管生成的关键因子；脂肪生成依赖于IRE1α/XBP1通路的激活,等等。但目前IRE1α激酶与核酸酶之间的相互调控关系及其与疾病关系尚不明晰。发现IRE1α激酶以及核酸酶的抑制剂,对IRE1α激酶与核酸酶之间的关系研究、IRE1α信号通路调控机制以及相关药物开发具有重要意义。我们在体外运用昆虫表达体系成功地表达纯化出人源重组IRE1α蛋白,通过对底物浓度、DMSO浓度的优化,我们建立了合格的IRE1α激酶抑制剂高通量筛选模型,该模型的Z’因子为0.58,CV值为7.5%,并对包含天然产物在内的12683个化合物进行了高通量筛选,最终获得了20个有效的IRE1α激酶抑制剂。随后,通过对底物浓度、DMSO浓度以及线性时间等条件进行优化,我们建立了分子水平的IRE1α核酸酶抑制剂筛选模型,并对包括细胞水平上的XBP1剪切抑制剂、NFκB-Luciferase抑制剂和分子水平上的IRE1α激酶抑制剂共810个化合物进行筛选,最终获得5个IRE1核酸酶直接抑制剂。IRElα-XBP1通路与脂代谢调控有着密切关系,但目前相关化合物应用主要集中在对多发性骨髓瘤的治疗评价,在脂代谢调控方面尚未见报道。本文首次对在XBP1剪切细胞模型上发现的活性化合物进行代谢调控的生物学活性评价,发现多个化合物具有抑制脂肪细胞分化和抑制肝细胞甘油三酯含量。综合考虑化合物对IRE1α核酸酶、激酶以及细胞水平对XBP1剪切细胞模型抑制活性,我们重点考察17#化合物对于脂代谢紊乱的调节作用。该化合物在分子水平上抑制IRE1核酸酶的活性,其IC50为14.92μM,在细胞水平上也显著抑制XBP1剪切,IC50约在10μM左右。功功能实验结果显示,17#化合物能明显抑制脂肪细胞3T3-L1的分化,而且抑制XBP1s以及FAS、ACC1、SCD1等相关基因表达：此外显著降低HepG2细胞中甘油三酯含量,而且抑制XBP1s、FAS、 ACC1、SCD1以及sREBP-c1等相关基因表达。综上所述,本论文的研究工作建立了IREl a激酶抑制剂分子模型以及IRE1α核酸酶的高通量筛选模型。IRE1α激酶以及核酸酶小分子抑制剂的发现为研究IRE1α激酶与核酸酶的关系提供了工具,也为IRE1α相关信号通路研究打下了基础；17#化合物的发现也为IRE1α/XBP1抑制剂在抗脂肪异常代谢类药物的开发上提供了新思路。