研究目的缺氧是实体肿瘤微环境的重要特征之一,当肿瘤体积生长至1mm3时,其内部一般都会有相当数量的肿瘤细胞处于缺氧状态。肿瘤可通过多种血管生成方式来缓解自身的缺氧状态。血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是由恶性肿瘤细胞形成的一种特殊的血液供应模式,其管道的管壁完全由肿瘤细胞而非内皮细胞构成,管腔内含有红细胞,周围没有坏死或炎症浸润。缺氧可以促进肝细胞肝癌VM的形成。本实验室前期研究表明缺氧可以促进Bcl-2蛋白和Twist1蛋白相互结合、作用,最终促进VM的形成,但其具体机制尚不明确。本研究拟探讨缺氧情况下Bcl-2蛋白与Twist1蛋白互作促进VM的机制。研究方法1、比较不同肝细胞肝癌细胞系的Bcl-2、Twist1表达情况,筛选出Hep G2细胞系和Bel7402细胞系。Hep G2细胞系高表达Bcl-2蛋白,低表达Twist1蛋白,Bel7402细胞系与之相反,低表达Bcl-2蛋白,高表达Twist1蛋白。2、应用氯化钴对体外培养的肝癌细胞系进行缺氧,应用western blot、免疫荧光观察缺氧后Bcl-2和Twist1蛋白表达的变化,并应用胶上三维培养观察缺氧前后细胞成管道能力的变化。3、运用质粒转染方法筛选出稳定过表达Twist1和Bcl-2蛋白的Hep G2细胞和Bel7402细胞,western blot、免疫荧光验证转染效果并用western blot检测转染后上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标记蛋白(E-cadherin、vimentin),干性标记蛋白(Bmi1、CD44、Oct4)和内皮相关蛋白(VE-cadherin、FLT1、KDR)的表达情况。4、运用划痕实验、侵袭实验、MTT、平板克隆形成实验及三维培养实验检测Bcl-2、Twist1共过表达对肝癌细胞系迁移、侵袭、增殖、克隆形成能力及管道形成能力的影响。5、使用si RNA建立稳定降表达Bcl-2的Hep G2细胞系和稳定降表达Twist1的Bel7402细胞系,破坏Bcl-2/Twist1蛋白互作。将对照组细胞和降表达组细胞同时进行缺氧,观察不同组别的细胞在缺氧0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,60 h时Bcl-2,Twist1,EMT标记蛋白,干性标记蛋白和内皮相关蛋白的表达变化。6、建立裸鼠右后肢缺氧模型,左后肢作为正常对照。将Hep G2细胞系和Bel7402细胞系分别接种裸鼠左右后肢,观察缺氧对肝癌细胞系成瘤能力的影响。运用免疫组化及endomucin/PAS双染技术检测移植瘤组织中的Bcl-2、Twist1、EMT标记蛋白、干性标记蛋白、内皮相关蛋白的表达情况及VM的形成情况,进一步明确缺氧对肝癌血管生成的影响。研究结果1、缺氧可以促进肝细胞肝癌细胞系中Bcl-2、Twist1的蛋白表达,Bcl-2过表达后可协助Twist1进入细胞核发挥作用。缺氧可以促进VM的形成。2、常氧条件下,Bcl-2、Twist1蛋白的共过表达也可以促进Twist1核转移,此外还可促进细胞vimentin、干性标记蛋白、内皮相关蛋白的表达,抑制细胞E-cadherin表达,并促进细胞的迁移、侵袭、增殖、克隆形成及管道形成能力(P<0.05)。提示常氧下,Bcl-2/Twist1互作促进肿瘤细胞发生EMT、获得干性并因此促进了形成VM的能力。3、降表达Hep G2细胞系中的Bcl-2蛋白或Bel7402细胞系中的Twist1蛋白破坏Bcl-2/Twsit1蛋白互作后,缺氧不能使降表达组形成Bcl-2/Twist1共过表达。与对照组相比,缺氧对降表达组EMT标记蛋白、干性标记蛋白、内皮相关蛋白的表达影响明显降低。缺氧可促进对照组细胞VM的形成,但降表达组缺氧前后均不能形成VM。4、体内试验中,缺氧组经过早期的缺氧阶段后,肿瘤生长速度较对照组快。与对照组相比,缺氧组中Bcl-2浆表达、Twist1核表达增高(P<0.05)。此外,与对照组相比,缺氧组vimentin,干性标记蛋白、内皮标记蛋白的表达也较对照组高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达较对照组低(P<0.05)。缺氧组的结论1、缺氧通过促进Bcl-2、Twist1蛋白表达和二者互作促进肝癌中VM的形成。Bcl-2可与Twist1结合并促进Twist1入核,从而导致大范围基因表达改变。2、Bcl-2、Twist1互作通过诱导肝癌细胞的EMT发生和增强肝癌细胞的干性来促进VM的形成。