引言 苯是一种重要的有机溶剂与工业原料。广泛应用于皮革、印刷行业。长期接触苯可引起骨髓损害，导致血细胞减少、再生障碍性贫血，甚至发生白血病。所以寻找安全、有效的细胞保护剂，使苯作业工人免受苯的损害非常重要。目前研究发现苯的毒性作用主要由其代谢产物1，4-氢醌，1，4-苯醌发挥作用。其主要作用机理是促进细胞凋亡，氧自由基的产生增加和DNA损伤引起的。而氨磷汀作为广谱细胞保护剂目前已广泛应用于临床，能选择性地保护正常细胞免受放疗和化疗的毒害作用，而且不降低化疗和放疗的疗效。氨磷汀还是一种多潜能造血刺激剂，保护多系造血祖细胞。它通过稳定正常组织中DNA分子，消除氧自由基，延迟由细胞因子启动的细胞凋亡过程等而发挥保护作用。氨磷汀除了对抗癌药物和放疗有明确的保护作用外，是否能更广泛地应用到对其他毒性物质的保护，是目前研究的一个方向。理论上推测，氨磷汀可以对苯引起的造血系统毒性具有保护作用，但目前国内外尚无此类文献报道。本课题通过研究体外培养条件下，氨磷汀对氢醌诱导的骨髓单个核细胞凋亡的影响，来探讨氨磷汀对苯骨髓毒性的保护作 浙江大学硕士研究生学位论文 用，为氨磷汀有可能作为苯作业工人保护剂提供一个理论依据。 材料和方法 1．取正常志愿者捐献的骨髓，肝素抗凝（50单位／毫升），淋巴细胞分离液 密度离心法分离制备成单个核细胞悬液。台盼蓝染色检测活细胞率，要 求拒染率达95％以上。 2．将细胞悬液置于56OC灭活的10％胎牛血清＋RPMI－1640液的培养体系中， 37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养。 3．氢酿AR由上海凌峰化学试剂有限公司提供，灭菌双蒸水配制成原溶液。 阿米福汀（注射用氨磷汀）由湖南银河生化工程有限公司提供，生理盐 水配制成原溶液。按不同倍数稀释成所需终浓度。 4．细胞凋亡检测方法：OLYMPAS荧光显微镜（型号70DX）HT（凋亡试剂 11）染色观察形态学，凋亡细胞核着色增强、核固缩、染色质浓集沿核 周分布，正常细胞核着色浅而均匀。1．2％琼脂糖凝胶电泳，电压30V， EB染色后出现典型可见DNA降解产物的“梯形”条带。流式细胞术 ANNEXIN V－FITC加碘化丙陡（PI）双染检测细胞凋亡率和坏死率，早期 凋亡细胞为Annexin”／PI，晚期凋亡和继发坏死细胞Annexin”／PI，正常 活细胞为 Annexin／PI。 5．分别加入终浓度为 0，25，50，75，150 W的氢酿，检测作用 2，6，12 小时细胞凋亡，获得氢酮诱导骨髓单个核细胞凋亡的最佳浓度，以此决 定下一步的氢酮浓度。 6．加入根据上一步实验得出的一定浓度氢酮与骨髓单个核细胞培养0，2， 4，6，8，m，12，侣，24小时，检测细胞凋亡，找出细胞凋亡的高峰 时间点，以作为此后实验的细胞凋亡检测时间点。 7．分别加入终浓度为0，2，10，50，100，500帅l氨磷汀力或不加氢醒 浙江大学硕士研究生学位论文 与骨髓单个核细胞培养至上一步实验得到的细胞凋亡高峰时间，比较各 浓度氨磷汀对细胞凋亡率的影响，找出毒性作用小，又能有效抑制氢醒 诱导的细胞凋亡的氨磷汀浓度。 8．分别于氢醒前30分钟加入，同时加入，氢醒后30分钟加入一定浓度的 氨磷汀，检测培养至细胞凋亡高峰时间的细胞凋亡率和坏死率的变化。 9．实验组设置①空白对照组（不加药物处理组）：加入双蒸水60ul和生理 盐水60N。②氨磷汀组：加入一定浓度氨磷汀。③氢醒组：加入一定浓 度氢现④氨磷汀＋氢醒组：同时加入一定浓度氨磷汀和一定浓度氢酿。 检测8，10，12，18，24，48小时各时间点各组凋亡率的变化。 10．统计学处理：用SPSS10．0软件包，均数用了土S表示，多组间比较采用 方差分析，多组间两两比较采用SNK检验，两变量的相关程度用直线相 关分析法分析。 结果 1．荧光染色发现，加用不同浓度氢酮出现细胞核荧光强度增强，核着色加 深，核着色不均匀，染色质浓集，染色质沿核周分布现象。氢醒浓度不同 时，典型的凋亡细胞出现率存在差异。骨髓单个核细胞与不同浓度氢醒培 养6小时都出现DNA“梯形”条带，进一步证实细胞凋亡的存在。 2．流式细胞术检测结果发现，不同浓度氢酿作用后，细胞凋亡率明显高于空 白对?