CD分子在血细胞的分化、增殖、活化、迁移以及机体防御性免疫应答、炎症、凋亡、自身免疫和器官发生等许多生理和病理过程中发挥着重要的作用。CD分子和CD mAb作为一种重要的手段和方法,已广泛地应用于生命科学的研究领域中,包括对基础医学理论以及多种疾病的发病机制、诊断、预防和治疗等临床医学的研究。CD8分子是T淋巴细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,也是T淋巴细胞重要的表面标志物,它作为粘附分子、辅助受体和免疫调节物广泛参与TCR对MHCI分子递呈抗原的识别和信号传递。CD8分子做为一类信号传递受体,其分子胞质部分与非受体型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56lck相连,参与TCR介导的信号级联反应。CD8分子包括CD8αα同型二聚体和CD8αβ异型二聚体,CD8同αα型二聚体分子在小鼠肠上皮下与非典型MHC I类分子作用,构成肠道免疫屏障。为了解膜蛋白分子在机体特异性免疫应答中的作用及其机理,本研究进行了pCD8β基因的原核表达和单克隆抗体的制备。根据本实验测定的pCD8β基因序列和原核表达载体pET-28a的多克隆酶切位点序列去掉信号肽设计一对引物,应用PCR技术从重组质粒pGEM-T-pCD8β中扩增出编码pCD8β蛋白的基因。PCR产物分离纯化后连接到原核表达载体pET-28a多克隆酶切位点,经质粒PCR鉴定和EcoR I , HindⅢ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建成pCD8β基因的原核表达质粒pET-28a-pCD8β。将这种原核表达重组质粒转化大肠杆菌BL21,经0.5mmol/L IPTG的诱导在28℃表达,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到表达,表达产物是以包涵体的形式存在的重组蛋白pET-28a-pCD8β,且所获得的重组蛋白分子量约为24Ku,与预期结果相符。通过优化原核表达条件,确定了重组质粒pET-28a-pCD8β的原核表达最佳诱导时间、温度和诱导剂浓度,并用优化后的条件对含有pET-28a-pCD8β质粒的BL21菌进行了大量诱导表达。使用反复冻融和超声方法来裂解表达菌,利用切胶法纯化目的蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,经过杂交瘤细胞的建立、融合细胞的筛选和克隆化培养,成功获得了一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经ELISA检测分析,用小鼠腹水制备的单克隆抗体的效价达l×l06;Western-blotting分析证明,此单抗能特异性识别pCD8β蛋白分子,这为研究猪CD8细胞及其亚群的组织分布、种类和数量的动态变化以及细胞表面标志的结构与功能奠定了基础。本研究成功地表达pCD8β基因,对其进行了大量表达,获得了大量的CD8β重组蛋白,并制备了针对该重组蛋白的单克隆抗体,为进一步研究猪CD8分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。