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沙门菌(Salmonella)是一种广泛存在的食源性人兽共患病原菌,可导致伤寒、胃肠炎、败血症等疾病,由于抗生素的大量和不规范使用,导致耐药现象日趋严重,其耐药机理的研究对食品安全和养殖业具有重要意义。沙门菌对不同类药物的耐药机理不同,且临床分离的沙门菌多为多重耐药菌株,不能针对性的研究单一药物的耐药机理,因此本实验采用单一药物对鼠伤寒沙门菌进行诱导产生相应的耐药菌株,研究CRISPR/Cas系统与耐药性的关系,探讨沙门菌的耐药机理。成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)存在于大多数细菌基因组中,和其位点下游的CRISPR相关蛋白基因(CRISPR associated,cas)组成CRISPR/Cas系统。该系统是细菌主要的免疫系统,具有识别和处理外源质粒、噬菌体等作用。目前已有研究表明CRISPR/Cas系统与细菌的耐药性有关。本实验通过体外诱导获得环丙沙星耐药菌株,对耐药菌株和标准菌株进行CRISPR/Cas系统的序列比对、cas mRNA表达水平的差异分析和Cas蛋白表达差异的分析。利用荧光定量PCR、串联质谱标签法(Tandem mass tag,TMT)和平行反应监测(Parallel reaction monitoring,PRM)靶向蛋白验证等实验手段,研究沙门菌CRISPR/Cas系统与氟喹诺酮类耐药性的关系。主要研究内容和结果如下:1.通过对鼠伤寒沙门菌ATCC 13311的CRISPR/Cas系统的匹配拼接,在基因组的3013863 bp-3014930 bp位置上检测到一段CRISPR序列,在其下游发现序列的8个cas基因序列,依次为cas2、cas1、cas6、cas5、cse4、cse2、casA、cas3,鉴定其为TypeⅠ-E型CRISPR/Cas系统。2.通过耐药菌株与标准菌株的CRISPR/Cas系统序列的比对,发现沙门菌获得氟喹诺酮类耐药性之后该系统发生273个单碱基的位点突变和20个碱基片段的插入或丢失。3.利用荧光定量PCR技术发现8个cas基因的mRNA表达水平在耐药菌株与标准菌株中有所差异。其中,cas3、cas5、cas6下调,cse2、cse4上调,cas1、cas2表达较稳定。4.利用TMT蛋白质组学定量结合PRM靶向验证技术发现Cse4蛋白的表达显著上调。5.将蛋白质组学的数据进行分析处理后,以2倍为变化阈值(Fold change≥2或≤0.5),p<0.05为标准进行差异蛋白的筛选,并作生物信息学分析。结果显示共筛选出了318个差异蛋白,其中上调159个,下调159个,包括外排泵相关蛋白、外膜蛋白、双组分相关蛋白及通路、细菌趋化性相关蛋白及通路等。选取的15个差异蛋白作PRM靶向蛋白验证,成功定量到13个且与TMT结果相符。本研究通过诱导获得氟喹诺酮类耐药菌株,从基因序列、转录水平、蛋白水平分析标准菌株与耐药菌株CRISPR/Cas系统的差异,同时利用TMT结合PRM技术筛选到了多个与耐药性相关的蛋白和代谢通路,为研究沙门菌CRISPR/Cas系统与耐药性的关系提供依据,为深入研究沙门菌的耐药机理奠定基础。