兔自体脂肪来源干细胞与肝细胞生长因子联合局部应用对增生性瘢痕的作用

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目的:(1)探索兔脂肪来源干细胞的提取与培养。改变传统脂肪干细胞的体外培养方法后观察脂肪来源干细胞的成活率的变化(2)探索兔耳瘢痕模型的可行性。(3)比较兔自体脂肪来源肝细胞和肝细胞生长因子单独应用及联合应用对兔耳增生性瘢痕的作用方法:选取(1)24只实验大白兔(均为雄性)。麻醉消毒后切取腹股沟皮下脂肪组织。用酶消化法提取干细胞。4×102个/ml接种于培养皿。利用倒置显微镜对原代培养的细胞每天进行形态学观察。(2)兔耳增生性瘢痕模型代替裸鼠移植瘢痕模型可行性研究:于10只实验兔的耳腹侧剃去兔毛并用直尺设计直径1cm左右的圆形创口。去除皮肤。止血油砂覆盖包扎。每只耳朵各做4个创口。创面形成后的30、50、80及120d。分别将增生块及周围正常皮肤一并取下。用甲醛溶液固定,石蜡包埋。切片,HE染色,在低倍镜下用测微尺测量增生块相对增生厚度。(3)通过进行兔自体脂肪来源肝细胞和肝细胞生长因子单独应用及联合应用用以比较各自对兔耳增生性瘢痕的作用。随机将24只实验兔分为A、B、C、D4组每组6只。A组(干细胞与肝细胞生长因子联合组)。B组(肝细胞生长因子组)。C组(脂肪干细胞组),D组(生理盐水组)。待兔耳手术后的10天、20天、30天分别于A组局部注射肝细胞生长因子注射液(浓度2.0mg/ml)与脂肪干细胞混合液(1:1)、B组局部注射肝细胞生长因子注射液(浓度2.0mg/ml)。C组局部注射脂肪干细胞。D组局部注射生理盐水。第35天在瘢痕处取材,观察其组织形态学及生化指标。结果:(1)改进提取、培养方法后,干细胞细胞数目增加了12%污染率减小18%原,以0.25%胰蛋白酶消化后1:2传代。传代后细胞增殖速度明显加快,一般4d左右达融合后可再次传代。实验显示,增殖能力旺盛,脂肪干细胞活性好、到第12代时仍不会下降。(2)瘢痕模型在术后第18天覆盖上皮,32天时增生最为明显,一直持续4个月后开始软化,但仍会有大约50%左右的创面的增生块会持续增生。(3)两种不同因素的单独应用及联合应用对兔耳增生性瘢痕的影响。形态学观察:A组(干细胞与肝细胞生长因子联合组)增生的瘢痕颜色多呈粉红色有的基本接近正常皮肤,质地较柔软,体积大多明显减小,与正常皮肤高度一致, B组(肝细胞生长因子组)瘢痕颜色多呈紫红色,稍微高于于周围正常皮肤。 C组(脂肪干细胞组)瘢痕块颜色多呈紫红色。部分瘢痕颜色呈粉红色,稍微隆起于周围正常皮肤。 D组(生理盐水组)瘢痕大多颜色较鲜红。瘢痕质地坚硬明显高出正常皮肤组织,突出皮肤,2.9~3.2mm.,质地较硬少部分体积略有缩小。结论:(1)改良后的兔脂肪干细胞体外培养较传统的兔脂肪干细胞提取方法,有提取细胞数量多不易污染的优点。传代培养可以获得具有分化能力的细胞。脂肪干细胞中有超过50%的细胞能成功分化为成熟的脂肪细胞,改进后提取培养法较传统方法细胞的数量增加了12%污染率减小18%。(2)兔耳瘢痕模型比较裸鼠移植瘢痕,它的优点是可以观察整个瘢痕的发生、发展、消退过程可以用于研究人体增生性瘢痕。(3)肝细胞生长因子和脂肪来源干细胞无论是单独还是联合都对瘢痕都有抑制作用,但联合应用对增生性瘢痕的作用比单独使用对瘢痕的抑制作用强,肝细胞生长因子与脂肪来源干细胞比较,干细胞比肝细胞生长因子对瘢痕抑制作用略强。
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