肿瘤骨转移是受多个因素调控的,通过严格调控肿瘤细胞与骨微环境中细胞的基因表达之间的相互作用来实现。miRNA可以作为基因表达的主要调控因子,参与控制骨转移形成的多个方面,包括从原发性肿瘤部位逃逸的癌细胞,癌细胞向骨髓的传播和骨髓的侵袭,以及二次生长和肿瘤间质细胞相互作用。在临床中,在骨形成细胞中已经鉴定了一些特异性的miRNA,因此提示miRNA可以用作肿瘤骨转移生物标志物的可能性。miRNA在骨微环境中的调节活性也表明miRNA可能是有希望的治疗靶点。研究目标为:(1)共表达分析揭示骨转移的关键基因模块;(2)肺癌骨转移患者中溶酶体下调及基因表达特征(3)筛选在肺癌骨转移的骨组织中差异表达的miRNA;(4)鉴定在骨转移时对破骨细胞功能有着重要调控作用的miRNA;(5)阐明该miRNA对破骨细胞分化、生长和成熟进行调控的信号通路和分子机制。方法:(1)我们利用WGCNA分析了共表达模块,并研究了共表达基因功能富集的重要模块。首先,在20个骨转移样本中对6,922个基因构建共表达模块。然后,使用WGCNA算法分析成对模块之间的中枢基因的相互作用关系。之后,对骨转移共表达模块中的基因进行功能注释分析。(2)我们对骨髓阴性和骨髓阳性标本的基因表达进行了分析。此外,通过构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,以找出这些差异表达基因之间的调控关系(DEGS)。用基因本体论(GO)和途径富集分析法对功能富集的生物过程和途径进行了分析。此外,从构建的蛋白-蛋白质相互作用(PPI)网络中筛选出核心蛋白。(3)从临床队列收集肺癌骨转移患者3例,脊柱损伤患者3例,从临床手术中收取肺癌骨转移骨组织标本,应用miRNA微阵列技术及qRT-PCR验证,分析了不同组别中miRNAs的表达谱差异,并对候选miRNA进行相关验证。本实验釆用丹麦EXIQON公司生产的LNATM mi RNA芯片(11.0版),每张芯片中包含1807个特异性探针、435个特有的探针。为保证结果的可靠性,上述每个探针在芯片内重复4次,即每张芯片对同一样本重复检测4次。所得数据用Genepix 6.0软件分析扫描结果。我们定义肿瘤组相对对照组表达水平大于2或小于0.5的为差异表达。(4)针对hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因设计各两条具有不同GC%的sgRNA,随后分别将它们构建入sgRNA表达载体和Cas9蛋白/sgRNA共表达载体。其中Cas9蛋白/sgRNA共表达载体能够同时表达sgRNA和Cas9蛋白,从而实现sgRNA和Cas9蛋白的共传递。分别将构建好的表达载体利用脂质体转染法转染入哺乳动物细胞中,通过T7E1 assay和DNA测序的方法检测其剪切效率。结果证明实验所设计的CRISPR/Cas系统的确能够在hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b靶点起作用,并且揭示不同的CRISPR/Cas系统对靶点剪切效率有所差异。为了整体敲除hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因,我们将打靶载体和CRISPR/Cas系统载体一同转染细胞,通过同源重组修复将hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b整个基因进行整体替换敲除,再利用嘌呤霉素抗性筛选的方法得到hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b敲除细胞。利用Real-Time PCR对hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因拷贝数检测以及测定细胞生长速度的方法比较hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b敲除细胞和野生型细胞间的差异。(5)根据我们前期所进行的在线生物信息学分析发现mir-154参与调控Wnt/β-catenin信号通路,DKK2蛋白对Wnt/β-catenin信号通路抑制特异性高,mir-154在Wnt/β-catenin信号通路存在特异性的DKK2靶基因。mir-154是通过碱基互补配对的方式识别DKK2的3’端非编码区(Untranslated region,3’-UTR)来降解或阻遏DKK2的翻译和表达。转染mir-154模拟物或mir-154抑制物到Raw264.7细胞,通过Western blot分析对这些转染细胞的DKK2的表达水平进行检测。通过生物信息学预测DKK2与mir-154在3’-UTR序列的结合靶点,通过点突变技术制备了突变型的3’-UTR序列,把突变型的3’-UTR和野生型的3’-UTR克隆到psiCHECK-2质粒。含有突变型的3’-UTR和野生型的3’-UTR的psiCHECK-2质粒与mir-154转染到HEK-293T细胞中,用双荧光素分析的方法来检测其荧光强度。(6)通过在Raw264.7细胞过表达Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白,借助抗酒石酸酸性磷酸酶染色,以及利用Wesrtern Blot的方法检测抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K这两种破骨细胞分化成熟的特异性标志物,分析Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白与Raw264.7细胞分化成熟的关系。结果(1)前5个模块的功能富集显示出很大差异,模块2富集了细胞粘附,ECM受体反应和细胞粘附分子。然后我们推断出模块中的两个基因是与骨转移相关的重要基因。(2)筛选出肺部骨转移中的差异表达基因(DEGs)和功能蛋白,表明CTSS,CTSD,MX1,NKX2-1可能在骨转移中起决定性作用。(3)我们通过对3例肺癌骨转移患者与3例非肺癌骨转移患者进行全基因芯片检测,聚类分析得到下调的共有82种,上调的共有112种。通过生物信息学预测分析,我们得到hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b在肺癌骨转移的骨组织中低表达。随后我们使用实时定量PCR法对上述miRNAs在肺癌骨转移的骨组织中组织中进行验证。结果显示,与对照组比较,肺癌骨转移的骨组织中hsa-miR-30d、hsa-mi R-154、hsa-miR-34b等miRNAs表达显著下降(P<0.01),其中以hsa-miR-154最为明显,其可能是调控肺癌骨转移的骨组织中相当保守的小RNA,影响肿瘤的发生发展。(4)T7E1酶切实验证实hsa-miR-30d基因片段经酶切后,能够观察到250 bp和360bp的小片段,hsa-miR-154基因片段被酶切后产生240bp和480bp的片段,hsa-miR-34b基因片段被酶切成220bp和520bp的片段。表明本实验针对hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因设计的CRISPR/Cas系统可以识别并敲除靶基因。经CRISPR/Cas系统处理过的细胞,对hsa-mi R-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b基因位点测序后发现,切割位点处的序列变得非常混乱无序。表明本实验设计的CRISPR/Cas系统可以有效的介导靶位点基因敲除。(5)通过Western blot分析,结果表明转染了mir-154模拟物的Raw264.7表达出了更低水平的DKK2。相反地,转染了MIR-154抑制物的细胞表达了更高水平的DKK2蛋白。通过点突变技术制备了突变型的3’-UTR序列转染后,突变型的3’-UTR序列不与mir-154结合,野生型的3’-UTR序列与MIR-154结合。把突变型的3’-UTR和野生型的3’-UTR克隆到psiCHECK-2质粒。含有突变型的3’-UTR和野生型的3’-UTR的psiCHECK-2质粒与mir-154转染到HEK-293T细胞中,用双荧光素分析的方法来检测其荧光强度。结果表明转染了野生型质粒和mir-154的HEK-293T细胞荧光强度明显低于对照组,而转染了突变型质粒和mir-154的HEK-293T细胞荧光强度与对照组无显著差异。(6)抗酒石酸酸性磷酸酶染色和Western Blot的方法检测抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K这两种破骨细胞分化成熟的特异性标志物。结果酸性磷酸酶和组织蛋白酶K这两种破骨细胞分化显示,Ad-β-catenin+RANKL组没有观察到TRAP阳性多核细胞;空白组可见少许TRAP阳性多核细胞;而添加了诱导因子的RANKL组、Ad-GFP+RANKL组中TRAP阳性多核细胞明显增多。Western Blot结果表明所有组都能检测到一条显色带但是Ad-β-catenin+RANKL组的显色带比其余三组都要浅。这些结果都证实了Wnt/β-catenin信号通路直接调控破骨细胞的分化成熟过程,并且这种调控作用为是抑制性的。结论(1)我们的研究结果提供了骨转移共表达基因模块的框架,并在功能方面进一步加深了对这些模块的理解。(2)证明肺癌骨转移将导致溶酶体功能的变化,影响老骨基质的分解和消除,从而影响骨转换。此外,我们的研究结果也为骨转移的预测和治疗提供了新的见解。(3)我们首次筛选并鉴定了肺癌骨转移后骨组织中差异表达的miRNA谱系特征,筛选并验证了hsa-miR-30d、hsa-miR-154、hsa-miR-34b在肺癌骨转移骨组织中低表达;(4)通过CRISPR/Cas系统验证了miRNA154在Raw264.7细胞的分化成熟中发挥了重要作用;(5)证实了mir-154可以通过直接抑制DKK2的翻译和表达从而上调β-连环蛋白的表达水平,进而激活经典的Wnt/β-catenin信号通路。(6)证实了Wnt/β-catenin信号通路直接调控破骨细胞的分化成熟过程,并且是抑制作用