RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指通过诱导同源mRNA降解导致特定基因发生转录后基因沉默。目前,RNAi技术已广泛应用于基因功能研究和基因治疗等领域。RNAi可以通过siRNA或shRNA来实现,shRNA普遍应用RNA聚合酶Ⅲ启动子来调控其转录,但此类启动子缺乏组织特异性,因此我们选择RNA聚合酶Ⅱ启动子来调控shRNA转录,从而实现RNAi的组织特异性。本研究采用RNA聚合酶Ⅱ启动子中的apoA-I启动子来调控shRNA在肝癌细胞中特异性表达,从而实现肿瘤基因治疗的肝靶向性。首先,本实验通过PCR扩增apoA-I基因启动子序列,并将其克隆至pEGFP的报告蛋白EGFP基因上游,构建肝靶向重组载体pAE。将其和阳性对照质粒pEGFP分别转染肝癌细胞和非肝癌细胞,以报告蛋白的表达为标志检测其组织特异性。结果表明apoA-I启动子能够特异性启动绿色荧光蛋白在肝癌细胞中表达,而在食管癌EC9706、乳腺癌MCF7、宫颈癌HeLa细胞中不表达,apoA-I启动子具有较强的肝细胞组织特异性,为肝组织靶向性基因治疗奠定了实验基础。其次,我们将肝特异性apoA-I启动子运用到RNAi载体构建中,期望实现肝癌的靶向性基因治疗,试验中用报告蛋白EGFP的表达下调情况来判定载体构建是否成功。由于apoA-I启动子属于PolⅡ启动子,它的转录调控机制有别于PolⅢ启动子,所以我们对shRNA的表达框进行结构修饰,添加了Ribozyme和MAZ结构,与未经修饰的质粒载体做对照,转染肝癌细胞,以报告蛋白的表达为标志检测其活性。实验结果表明,本研究构建的apoA-I启动子调控的RNAi载体不仅能够有效实现RNAi作用,同时可以有效降低脱靶效应,为PolⅡ启动子在RNAi中的应用奠定了实验基础。RNAi具有序列特异性的特点,因此碱基突变、缺失等都可能对RNAi效果产生一定的影响。在本研究中,对于PolⅡ启动子调控的shRNA序列中碱基缺失对RNAi效果的影响也进行了初步探索,在上步实验验证有RNAi作用的shRNA序列正义链3’端设计碱基缺失,和未缺失的质粒做对照,转染肝癌细胞,以报告蛋白的表达为标志检测其活性。研究结果发现,在PolⅡ启动子调控的shRNA正义链上进行碱基缺失,shRNA载体也具有一定的RNAi效果,为深入探索RNAi的干扰机制进行了初步的尝试。肿瘤的发生和发展是一种复杂的过程,涉及多种基因、多种因素的综合作用,因此联合基因治疗已成为肿瘤基因治疗研究的新方向。为了实现高效、稳定的双基因沉默,并预防RNAi逃逸,在本研究中,我们构建双基因RNA沉默载体pSAD-EGFP和pDAF-EGFP,共转染肝癌细胞,以报告蛋白的表达为标志检测其活性,尝试联合RNAi的可行性。结果显示两种质粒对EGFP都具有沉默效果,为肿瘤的联合RNAi基因治疗奠定了很好的实验基础。