副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌,特定条件下可入侵机体引起严重的全身性感染,称为格拉瑟氏病,表现为多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。世界各主要养猪国家都有该病发生或流行的报道,而且随着养殖模式的转变,该病的流行呈现上升趋势,副猪嗜血杆菌也已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性病原,迫切需要对该病原的分子致病机理进行剖析阐释,才能有针对性地制定出高效的综合防治策略。高通量研究方法包括全基因组测序、比较基因组学、蛋白质组学、转录组学等相继应用于该病原,大量的潜在毒力因子被筛选出来。验证这些猜想和推论,传统的遗传操作工具不可或缺。当前遗传操作工具的缺乏,便成为了阻碍深入研究副猪嗜血杆菌致病机理和防治措施的瓶颈。因此,构建出一套适用于该病原的遗传操作系统是当前这一领域的首要任务。本研究从副猪嗜血杆菌田间分离株中筛选内源性质粒,选用质粒上的元件构建了适用于该病原的穿梭载体、表达载体及温敏复制型载体,同时优化了副猪嗜血杆菌的电转化方法,可在副猪嗜血杆菌内实现特定基因的超表达,为基因缺失株的构建提供必要的技术支撑,为该领域的应用基础研究奠定了重要基石,主要研究内容如下：1.副猪嗜血杆菌野生质粒的筛选2005年-2007年,从全国各地猪场分得的110株副猪嗜血杆菌分离株中,筛选出10株菌携带有内源性质粒。我们对其中6个质粒(pYZ18、pYC93、pFZ51、pWH24、pZK15、pHN61)进行了全序列的测定,利用NCBI网站的ORF Finder工具和Blast工具,注释了质粒序列的开放读码框。在测序完成的这6个质粒中,有3个质粒的复制过程不需要质粒编码的复制蛋白的参与,即pYZ18、pYC93和pZK1 5。后两者序列一致,可能是同一个质粒水平转移的结果；而pYZ18与后两者的复制区核苷酸序列达到81%的相似性。据此,我们推断这3个质粒的复制方式相同,但实验结果表明3个质粒拷贝数有较大差异,这可能正是缘于序列差异的位点与质粒拷贝数的控制有关联。另3个质粒的复制过程则需要质粒编码的复制蛋白的参与,其中pHN61与pFZ51的复制区核苷酸序列完全一致,pWH24的复制区与它们相比有很大差异,这包括了编码复制蛋白的序列和非编码区。6个质粒中,除pWH24可能是隐性质粒外,其余都携带有抗性基因,且各不相同(pZK15与pYC93看作同一个质粒)。其中,林可胺类抗生素抗性基因lnuC在革兰氏阴性菌中首次报道,tetH与其抑制基因tetR在副猪嗜血杆菌中属首次发现,像pZK15这样带有7个抗性基因的多重耐药质粒在副猪嗜血杆菌中也是第一次发现。根据质粒的拷贝数的粗略估计,以及质粒的稳定性和复制子的分布广泛性,选取了质粒pYC93的复制起始位点、质粒pFZ51上的氨苄青霉素和氯霉素抗性基因表达盒这些元件,作为后续构建副猪嗜血杆菌质粒载体的组分。2.穿梭载体pSHK4的构建大肠杆菌和研究对象之间穿梭载体是研究对象遗传操作系统中最基础的组分,它包括两个要素：能在两种宿主菌中稳定遗传的复制子；适合于两种宿主菌的筛选标记。根据以往巴斯德菌科成员中可发挥功能的抗性基因的研究结果,我们选取了在载体工具中常用的来源于Tn10的卡那霉素抗性基因作为穿梭载体的抗性筛选标记。穿梭载体的复制子则结合了两种宿主菌的复制起始位点,组合成一个质粒骨架,即利用了副猪嗜血杆菌中内源性质粒pYC93的复制起始位点和商业化克隆载体的ColE1家族复制起始位点。加上商业化克隆载体多克隆位点,通过重叠PCR的方法将必需的四个元件串联并环化,构建了能在大肠杆菌与副猪嗜血杆菌中稳定遗传的穿梭载体pSHK4。我们在质粒三个主要独立组分之间的引入了酶切位点NcoI和NdeI,可因后续实验需要在这两处加入DNA序列,便于将来构建具有其他拓展功能的载体。利用该载体高拷贝、易于大量制备的特性,我们用其转化副猪嗜血杆菌的血清参考菌株和田间分离株,系统地研究了该菌的电转化方法,不断优化感受态制备和电转化的各个操作环节,基本解决了副猪嗜血杆菌菌株中广泛存在的转化难问题。载体pSHK4转化到大肠杆菌和副猪嗜血杆菌中后,分别于无抗生素培养基中转接25代,该载体一直稳定存在于两种宿主菌中,验证其作为穿梭载体的遗传稳定性。3.表达载体pK3EX的构建在穿梭载体的基础上,我们引入元件：副猪嗜血杆菌中看家基因rpsJ(产物为30S亚基核糖体蛋白S10)的转录启动子、lacO基因、lacI基因、组氨酸标签序列及转录终止子,构建了在副猪嗜血杆菌中可用IPTG进行诱导表达的表达载体pK3EX。转录启动子扩增自副猪嗜血杆菌SH0165菌株的基因组,lacO基因、lacI基因和组氨酸标签序列扩增自商业化载体pET28a,转录终止子扩增自内源性质粒pHN61。调节基因lacO插于启动子序列和多克隆位点之间,是lacI基因产物的结合位点；lacI基因上游序列引入了副猪嗜血杆菌Wza基因的天然启动子,以保证该基因能在副猪嗜血杆菌中顺利表达,从而达到最大程度降低克隆基因本底表达的目的；转录终止子前面是6His标签的序列及紧接的终止密码子,以便利用亲和柱层析方法对表达产物进行纯化。我们将副猪嗜血杆菌SH0165基因aidA成功克隆到pK3EX载体SalI和Xbal位点之间,获得重组质粒pK3EX-AT1,重组质粒转化到菌株174中,通过Western blotting试验证实了该基因在菌株174中超表达的效果明显；并利用表达产物融合的6His标签,通过Ni离子亲和层析柱纯化了目的蛋白AidA。表达载体的构建,为副猪嗜血杆菌毒力因子的研究提供了有力的工具。对内源性基因进行超表达,研究超表达菌株的表型变化,即可探知目标基因在菌株生存或致病力方面所起的作用；表达载体还可用于缺失突变株互补菌株的构建。总的说来,副猪嗜血杆菌表达载体pK3EX的成功构建,有助于我们深入理解这种重要的猪病原菌的致病机理。4.温敏复制型载体系列的构建本研究通过用合成的温度敏感复制起始位点置换穿梭载体pSHK4中的pYC93复制起始位点,构建了温敏复制型载体pSHK4TS,可用于构建副猪嗜血杆菌无抗性标记的基因缺失突变株。此突变策略多基因缺失突变株的构建提供了便利。另外,无抗性标记的缺失突变株具有直接用作弱毒疫苗的潜在可能性,在研究病原菌毒力因子的同时,实现基因工程疫苗的构建。但我们在实际操作中,质粒整合到副猪嗜血杆菌基因组上的单交换菌株很容易获得,第二次交换质粒从基因组上解离后生长出的克隆却均为回复野生型。考虑到可能由于突变株的体外培养与野生菌株混合-起缺乏竞争优势而不能存活到最后,我们进一步改造了载体构造,将卡那霉素抗性基因置于多克隆位点中央,在质粒骨架上添加第二个抗性基因氨苄青霉素或氯霉素抗性基因,获得两个温敏复制型载体pAK5TS和pCK5TS。另外,载体pAK5TS和pCK5TS卡那霉素抗性基因表达盒的两翼引入了FRT序列,由此构建的HPS突变株,可进一步利用FLP位点特异性重组酶消除基因组中的抗性标记。如此,不仅避免了抗性基因插入突变位点造成的极性效应,有利于更明晰的阐释突变株表型变化的分子基础,而且可望在同一株菌内连续突变多个基因,并将毒力显著降低的突变株直接用作预防格拉瑟氏病的减毒活疫苗。