人蛋白C(human Protein C，hPC)是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，属血浆糖蛋白，相对分子量是62KDa。蛋白C系统是一种重要的抗凝机制之一，该系统由蛋白C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白S(PS)、蛋白C抑制物及新近发现的内皮细胞蛋白C受体(EPCR)组成。活化蛋白C的主要功能是抗凝、抗炎和促纤溶。近年来，活化蛋白C在感染性疾病，特别是在严重脓毒症、内毒素血症和弥散性血管内凝血等严重感染性疾病中的治疗备受关注。随着人血浆PC及重组人蛋白C(recombinant human Protein C，rhPC)在疾病治疗应用范围的扩展，建立简便、快速、灵敏和特异的人PC检测方法显得尤为重要。目前，国外的蛋白C制品(血浆浓缩剂及重组制剂)和诊断试剂价格较昂贵，不适合临床的推广应用。国内蛋白C的研究处于起步阶段，因此对蛋白C制品及诊断试剂的研究将有广阔的市场前景。本研究包括：1 物理化学方法纯化人血浆蛋白C：将3000ml新鲜冷冻血浆为起始材料，以DEAE-Sephadex A 50为吸附介质，收集洗脱产物，再经DEAE-Sepharose FF及肝素-Sepharose CL 6B层析，对收集产物进行APTT、SDS-PAGE及Western blotting检测，获得纯度大于95％的人血浆蛋白C。2 人蛋白C cDN_A在CHO-dhfr细胞中的表达：利用脂质体转染技术将含有人蛋白C cDNA基因和二氢叶酸还原酶基因的载体转入CHO细胞中，经过MTX中文摘要博士学位论文(6.4umol/L)抗性筛选，APTT、SDS一PAGE及westem blotting检测获得了6株高表达的细胞株。 3人蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定:利用人血浆蛋白C纯化产物免疫BALB/C小鼠制备了5株人蛋白C单克隆抗体细胞株，分别进行了效价、亚类、特异性及亲和力等鉴定。 4人蛋白C单克隆抗体的初步应用 l)酶联免疫分析法检测人血浆蛋白C:利用两株识别不同人蛋白C位点的单克隆抗体细胞株建立了夹心ELISA检测人血浆蛋白C。此方法可用于检测血浆中3.12~ZO0ng/mL范围内蛋白C，实验可在4小时内完成，实验的批内和批间变异不超过7%，测得102份正常血浆样品的参考范围是4.02士0.295林留mL 2)亲合层析法纯化人血浆蛋白C:先用DEAE一S叩hadexA一50吸附人血浆，然后将吸附产物过人蛋白C单克隆抗体与澳化氢活化的SePharose 4B偶联制备亲和层析柱，获得人蛋白C的纯化产物。此方法可使纯化产物浓缩16700倍，纯度超过99%。 本研究建立了人血浆蛋白C的纯化(物理化学纯化与亲和层析)方法，有望用于规模化生产;在国内首次实现人蛋白C CDNA在dhfr缺陷型CHO细胞中的高效表达，为今后蛋白C的进一步研究打下了基础;建立了抗人蛋白C单克隆抗体杂交瘤细胞系，利用两株识别不同抗原位点的单克隆抗体建立了夹心EL工SA检测人血浆蛋白C的方法，为临床检测人血浆蛋白C奠定了基础。