【摘 要】
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本试验选取国内常用的两个传染性支气管炎表达（IBV）商品化疫苗株（H120和4/91）及一个首次在西南地区分离到的TC07-2型的分离株ZQX作为试验对象,进行动物免疫攻毒试验,测定不同时相固有免疫相关基因的表达变化,从天然免疫角度对两个疫苗株免疫机理进行分析,为IBV的免疫机理和TC07-2型毒株的致病机理的研究提供参考。本试验选取了一个内参基因（ACTB）和五个天然免疫相关基因（TLR3、TL
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本试验选取国内常用的两个传染性支气管炎表达（IBV）商品化疫苗株（H120和4/91）及一个首次在西南地区分离到的TC07-2型的分离株ZQX作为试验对象,进行动物免疫攻毒试验,测定不同时相固有免疫相关基因的表达变化,从天然免疫角度对两个疫苗株免疫机理进行分析,为IBV的免疫机理和TC07-2型毒株的致病机理的研究提供参考。本试验选取了一个内参基因（ACTB）和五个天然免疫相关基因（TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6）进行研究,采用相对荧光定量中的2-ΔΔCt法对它们分别定量,计算表达倍数。本试验根据已经在Gene Bank上公布的基因序列进行引物设计,成功构建了内参基因和目的基因的标准曲线,结果显示:所构建的ACTB、TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6荧光定量PCR（Real-time PCR）标准曲线的扩增效率（E）分别为:1.93、2.00、2.01、1.93、2.09、1.93,相关系数（R~2）分别为:1.00、0.99、0.99、0.99、0.99、1.00,扩增产物的溶解峰均为特异性单峰,所构建的六个标准曲线具有良好的线性关系;敏感性结果显示,Real-time PCR的敏感性比普通PCR强100倍;重复性结果显示,在10~2～10~7copies/μL范围内批内及批间均具有良好的重复性。综上所述,所建立的一个内参基因及五个目的基因的荧光定量PCR标准曲线扩增效率均符合要求,且特异性好、灵敏度高、稳定性好,能用于对目的基因进行相对定量。为了研究两种疫苗免疫鸡分别被ZQX感染后引起的固有免疫相关基因在不同时相的表达差异,1日龄的SPF鸡被分成A、B、C、D共4组,在10日龄时分别对C、D两组鸡接种H120和4/91,A、B组接种等量PBS,24日龄时对B、C、D组进行攻毒（均为ZQX）,A组接种等量PBS,各组分开隔离饲养至攻毒后7d。攻毒后观察并记录各组临床症状、发病率、死亡率及剖检病变。在攻毒后1、3、5、7d测定各组鸡气管粘膜中各个基因的表达情况,分析其中的差异。结果显示:从临床症状和发病率死亡率分析,H120和4/91对IBV ZQX均有一定的保护作用;从单个固有免疫相关基因的在不同时相的表达水平上看,TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6在某个时间点均有表达上调,说明它们在抵御IBV ZQX感染中都发挥了作用;从各个基因表达倍数的最高值看,MDA5、IL-6、TLR3位于前列;从表达高峰出现的时间上看,H120免疫组各个基因的表达高峰几乎都早于4/91免疫攻毒组。综上所述,疫苗株H120和4/91对ZQX都有一定的保护作用。所选取的五个目的基因在抵御IBV ZQX感染中都发挥了一定的作用,但MDA5、IL-6和TLR3发挥作用更为显著,且H120免疫组感染ZQX后固有免疫相关基因表达比4/91免疫组更为迅速。
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