【摘 要】
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8-异戊烯基柚皮素（8-Prenylnaringenin,8-PN）是一种有价值的药用植物雌激素,同时也是合成许多异戊烯基黄酮类化合物的前体。目前,8-PN的生产主要依赖于植物提取法,但是,植物中8-PN的含量较低,且同分异构体的存在对下游分离和纯化过程造成一定困难。利用合成生物学技术改造微生物合成8-PN是替代传统生产方式的重要手段。微生物合成8-PN主要面临三个问题:信号肽对异戊烯基转移酶（P
【基金项目】
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国家自然科学基金优秀青年基金项目（21822806）“合成生物技术与生物系统工程”; 国家自然科学基因项目（21908078）“淫羊藿苷合成中关键异戊烯基转移酶的挖掘及其调控研究”
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8-异戊烯基柚皮素（8-Prenylnaringenin,8-PN）是一种有价值的药用植物雌激素,同时也是合成许多异戊烯基黄酮类化合物的前体。目前,8-PN的生产主要依赖于植物提取法,但是,植物中8-PN的含量较低,且同分异构体的存在对下游分离和纯化过程造成一定困难。利用合成生物学技术改造微生物合成8-PN是替代传统生产方式的重要手段。微生物合成8-PN主要面临三个问题:信号肽对异戊烯基转移酶（Prenyltransferases,PTs）结构和功能的干扰、前体供给不足以及PTs自身活性较低。为解决上述问题,本研究以一株能够高产柚皮素的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株E32为底盘细胞,结合代谢工程和蛋白质工程的方法,实现了8-PN高效异源生物合成。研究结果为异戊烯基黄酮的生物合成提供了一定的参考价值。论文的主要结果如下:（1）8-PN合成途径的构建及表达优化。本研究根据序列比对的方法,筛选了6个不同物种来源的PTs,分别预测信号肽并进行截短。确定了苦参来源的SfN8DT-1以及截短至E81位点的tSfN8DT-1具有合成8-PN的能力,同时发现对SfN8DT-1截短显著提高了其合成能力,8-PN的产量提高了108.37%。随后,对tSfN8DT-1的表达进行优化,筛选了酿酒酵母内源不同表达强度的14个启动子,并确定GAL7p为最适合tSfN8DT-1表达的启动子。最终,在发酵120 h后,8-PN在250 mL摇瓶中的产量达到4.98 mg×L-1。（2）异戊烯基转移酶N端信号肽截短强化8-PN的合成。通过对野生型SfN8DT-1进行结构模拟,结果显示其由包含多个α螺旋的主体结构以及一段包含120 aa的侧链构成。后续基于侧链结构,选取侧链17个不同氨基酸位置进行截短,发现对侧链不同氨基酸残基位点进行截短对8-PN的合成产生不同的影响,其中截短至K62位对8-PN的合成能力提高最明显。随后通过分子对接、丙氨酸扫描突变以及饱和突变,鉴定出K185为保守的关键氨基酸残基,其可能参与柚皮素与DMAPP的结合过程。比较SfN8DT-1-t62和tSfN8DT-1合成8-PN的能力,发现tSfN8DT-1具有更好的合成能力和潜力。（3）前体供给强化及蛋白质改造提高8-PN的合成。通过序列比对,挑选出12个低保守位点,并对这些位点进行定点突变,获得了6个正向突变体,其中,突变体tSfN8DT-1Q12E将8-PN的产量提高了114.51%。然后,对甲羟戊酸途径关键基因tHMGR和IDI1进行不同拷贝数的过量表达,当同时过量表达双拷贝的tHMGR和IDI1时,显著提高了8-PN的产量。通过蛋白质3D结构模拟和虚拟饱和突变,预测出两个关键氨基酸残基:P229和N305,对其进行饱和突变,获得突变体tSfN8DT-1Q12E N305M,将8-PN产量进一步提高至49.35 mg×L-1。最终,在5-L发酵罐培养后,8-PN产量达到101.40 mg×L-1。
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