蓝舌病(Bluetongue，BT)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的传染性疾病，BTV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属，目前有27个血清型，BT通过库蠓等媒介在反刍动物之间传播。不同血清型的BTV感染动物表现出不同临床症状，不同流行地区动物感染BTV也会表现出不同的临床症状。近二十年来，随着全球各国之间动物贸易往来日益增加和全球气候的变化，BTV在全球范围内迅速扩散传播。
　　BTV基因组由10个双股正链RNA组成，分别由10个节段基因编码7种结构蛋白VP1-VP7和4种非结构蛋白NS1-NS4和NS3a。其中VP2蛋白是BTV的血清型特异性抗原。VP7是BTV的群特异性抗原，不同血清型之间的VP7蛋白的同源性高达94％，VP7可诱导产生中和抗体，VP7蛋白用于建立BTV特异性血清学检测方法的最佳选择’也是BTV抗体检测的理想抗原。BTV14曾被用于制备弱毒疫苗。2012年，BTV14传入波兰。令人吃惊的是，此前波兰国内从未检测到任何血清型的BTV。这表明存在新型BTV血清型传入新地区的风险，BTV14的检测可作为有潜在传播的风险指示。本课题旨在针对14型蓝舌病毒的VP7蛋白的原核表达及纯化，建立间接ELISA检测方法作为特异性血清学检测方法，为后续检测试剂金的研发做好铺垫。
　　1.14型蓝舌病毒VP7蛋白的原核表达与纯化
　　由S7基因编码的VP7蛋白是BTV保守蛋白。根据GenBank发表的BTV14S7基因序列设计引物，首先提取BTV14的病毒RNA，经RT-PCR扩增S7基因。经双酶切将S7基因克隆至原核表达载体PET-32a，构建重组质粒pET-32a-VP7。对重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析，结果正确，重组质粒构建成功。将重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞进行诱导表达，并对表达条件进行优化。诱导产物经十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果显示重组VP7蛋白在原核表达系统中得到大量表达，同时Western Blot结果显示VP7蛋白与HIS标签融合表达。接着对包涵体沉淀进行纯化，利用纯化后的VP7蛋白作为检测抗体效价的包被抗原进行下一步研究。
　　2.14型蓝舌病毒兔血清抗体间接ELISA检测方法的建立
　　Vero细胞扩增BTV14，纯化后作为抗原接种免疫5只日本大耳兔，首次免疫三周后进行加强免疫，每两周加强免疫1次，共免疫5次。用间接ELISA检测方法检测阳性血清的效价，结果为1∶8192。利用亲和层析的方法纯化抗血清，SDS-PAGE结果显示纯化效果良好，无杂蛋白存在。通过优化反应条件，成功建立了VP7间接ELISA检测方法，该方法不与羊口蹄疫、羊痘病毒、和牛流行性腹泻病毒的抗体发生交叉反应，表明该方法具有很好的特异性;同时，结果也显示该方法具有很好的敏感性。可见，利用VP7蛋白抗体建立的间接ELISA检测方法具有进一步的应用价值。