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研究目的:
本实验室前期研究发现PTD-Foxp3融合蛋白可以高效进入细胞,使CD4+T细胞转变为Treg样细胞,而且此Treg样细胞可以通过细胞-细胞的接触以及细胞-细胞因子的作用抑制CD4+CD25T细胞的活化增殖;本课题研究PTD-Foxp3融合蛋白关节局部注射后对小鼠类风湿性关节炎模型的治疗作用,并通过检测腹股沟淋巴结中Treg样细胞和Th17细胞比例的变化,初步探讨PTD-Foxp3融合蛋白治疗作用的机制。
研究方法:
(1)PTD-Foxp3质粒和Foxp3质粒转化Rosetta感受态菌,诱导PTD-Foxp3蛋白和Foxp3蛋白表达,包涵体经镍柱纯化,纯化后的蛋白经脱盐柱、去内毒素柱进一步纯化,SDS-PAGE蛋白电泳鉴定;
(2)胃蛋白酶法消化鸡软骨制备鸡Ⅱ型胶原蛋白(chickentypeⅡcollagen,CCⅡ)并SDS-PAGE蛋白电泳鉴定;
(3)雄性DBA/1J小鼠初次免疫时在尾根部皮下注射0.1mLCCⅡ和福氏完全佐剂(completeFreund’sadjuvant,CFA)的乳化剂;3周后再次免疫时在尾根部皮下注射0.1mLCCⅡ和福氏不完全佐剂(incompleteFreundsadjuvant,IFA)的乳化剂,建立胶原诱导的关节炎(collagen-inducedarthritis,CIA)模型;
(4)初次免疫后第22天到第50天,每周三次关节局部注射PTD-Foxp3融合蛋白,用PBS和不带PTD序列的Foxp3融合蛋白做阴性对照,MTX做阳性对照:
(5)对各治疗组CIA小鼠关节炎严重程度进行评分并比较各治疗组关节炎发生率;
(6)小鼠关节组织的冰冻切片进行苏木素-伊红染色,并显微镜下观察各治疗组的组织病理学变化;
(7)取腹股沟淋巴结中淋巴细胞进行相应荧光标记抗体染色,流式细胞术检测Treg样细胞和Th17细胞。
研究结果:
(1)SDS-PAGE蛋白电泳显示成功诱导表达并纯化了PTD-Foxp3和Foxp3融合蛋白;
(2)所提取的CCⅡ同sigma公司的CCⅡ具有相同的电泳条带,并且用雄性DBA/1J小鼠能成功建立CIA模型;
(3)体内试验表明,PTD-Foxp3融合蛋白可以有效降低CIA小鼠关节炎的发病率和平均关节炎指数;
(4)病理切片显示PTD-Foxp3融合蛋白对炎症细胞浸润、血管翳的形成、软骨的破坏以及骨的损坏具有较好的抑制作用;
(5)流式分析表明PTD-Foxp3融合蛋白可以有效提高Treg样细胞/Th17细胞的比率。
研究结论:PTD-Foxp3融合蛋白可以有效抑制CIA小鼠类风湿性关节炎的发展,机制可能是PTD-Foxp3融合蛋白上调了Treg样细胞/Th17细胞的比率。