卵巢恶性肿瘤、子宫颈癌和子宫内膜癌是女性生殖器最常见的三大恶性肿瘤。卵巢恶性上皮性肿瘤占卵巢恶性肿瘤的85~90%。上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）在女性生殖道恶性肿瘤中死亡率最高，全世界每年有近204，000女性诊断患有卵巢癌，近125，000死于该疾病，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌起病隐匿、原发灶隐蔽，患者早期缺少临床症状、不易发现，3/4的患者初诊时通常已经进展到疾病中晚期（FIGO III～IV期），且肿瘤具有易播散转移、术后易复发且易产生化疗耐药等特点。随着医学和科技水平的进步，即使采取了包括临床肿瘤细胞减灭术和联合化疗等综合治疗手段，并改进了外科手术方法、增加了新的化疗方案，对于最常见的EOC，长期以来，国内、外的资料显示该疾病患者5年生存率始终停留在30％左右。卵巢癌的侵袭转移恶性行为是导致卵巢癌治疗失败，死亡的主要原因，因此它的恶性生物学行为及其分子生物学机制一直是肿瘤学研究领域中的热点。恶性肿瘤的发生、发展及转移是一个复杂的生物学过程，癌细胞先在原位生长，而后向邻近组织侵袭，使其发生破坏，然后从原发灶脱离，侵入血道﹑淋巴道，进而在远处形成转移瘤。在这一过程中，癌细胞向邻近组织的侵袭生长是肿瘤转移发生的起始步骤，而这种对邻近组织的侵袭性又依赖于癌细胞的定向极化运动能力，即癌细胞伪足往某一方向持续延伸的动力，这一动力是通过肌动蛋白的聚合所提供。因此探讨癌细胞极化运动机制，进而控制肌动蛋白在癌细胞伪足部位的聚合，可以达到早期控制癌细胞侵袭转移的目的。课题组前期研究采用反向捕获抗体芯片技术在对“吸烟与粘液性卵巢癌的发病相关性研究”和在“上皮性卵巢癌早期诊断研究”中发现，Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族富含脯氨酸同源蛋白1（Wiskott–Aldrich syndromeprotein family verprolin-homologous protein1，WAVE1）是同时存在于两组研究结果中血清抗体的差异性表达蛋白，可能是EOC细胞的一个标志蛋白。WAVE1基因在1998年发现并命名，主要负责将细胞信号从酪氨酸激酶受体和Rac传递至细胞骨架，从而发挥其调节肌动蛋白聚合及细胞骨架重排的作用并最终形成片状伪足。研究发现在黑色素瘤、前列腺癌、白血病等恶性肿瘤中，WAVE1均高度表达，提示WAVE1在肿瘤的侵袭转移过程中发挥着重要作用。但国内外目前尚无WAVE1在EOC恶性行为中的相关研究报道。因此，本课题将分为以下四部分对WAVE1在EOC恶性行为中的作用及其机制进行初步研究。第一部分WAVE1在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义目的：检测WAVE1在EOC组织标本中的蛋白表达情况，探讨EOC组织中WAVE1的表达与临床病理特征之间的相关性。方法：（1）采用免疫组织化学法检测223例EOC组织标本，29例交界性卵巢肿瘤标本，44例良性肿瘤标本和24例正常卵巢组织标本中WAVE1的表达情况，分析WAVE1的异常表达与临床病理特征之间的关系。（2）采用Western blot法检测其中44例EOC组织标本，16例交界性卵巢肿瘤标本，32例良性肿瘤标本和22例正常卵巢组织标本中WAVE1的表达情况，并分析WAVE1的异常表达与临床病理特征之间的关系。（3）采用Kaplan–Meier生存分析比较EOC患者组织中WAVE1表达强弱对生存时间的影响；Cox回归分析探讨有关EOC患者生存时间的影响因素。（4）应用Western blot法检测EOC细胞株SKOV3，OVCAR-3，ES-2和3AO细胞中WAVE1蛋白表达情况，采用激光共聚焦显微镜分析WAVE1在卵巢癌细胞株中的亚细胞定位。结果：（1）免疫组织化学结果显示，在223例EOC组织中，163例（73.1%）呈WAVE1强阳性表达，60例（26.9%）呈WAVE1低表达或不表达；在交界性卵巢肿瘤、良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中分别有23例（79.3%）、37例（84.1%）、23例（95.8%）呈WAVE1不表达，差异均有统计学意义（P<0.05）。在EOC组织中，WAVE1蛋白的表达水平在FIGO III~IV期组织中显著高于I~II期（P<0.001），中低分化细胞中的表达显著高于高分化（P<0.001），血浆Ca-125≥35U/ml的EOC患者组织中表达显著高于Ca-125<35U/ml的患者组织（P=0.013），术后残余瘤≥1cm的EOC患者组织中表达显著高于术后残余瘤<1cm的患者组织（P=0.036），但与EOC患者年龄、病理类型、肿瘤大小、腹水及病灶单双侧无关（P>0.05）。（2）Western blot结果显示，WAVE1在EOC组织中的表达（0.930±0.188）显著高于交界性卵巢肿瘤（0.586±0.098）、良性卵巢肿瘤（0.542±0.103）和正常卵巢组织（0.441±0.097），差异均有统计学意义（P<0.05）。在EOC组织中，WAVE1蛋白的表达水平与EOC FIGO分期、组织分化、血浆Ca-125及术后残余瘤有关（P<0.05），而与患者年龄、病理分型、肿瘤大小、腹水、病灶单双侧无关（P>0.05），该实验结果与免疫组织化学结果一致。（3）生存分析显示WAVE1低表达的EOC患者生存时间显著长于WAVE1高表达患者（P<0.05），多变量分析表明WAVE1高表达、EOC分期中晚期和不理想的肿瘤减灭术分别是EOC预后的独立因素。（4）WAVE1在EOC细胞株SKOV3，3AO，OVCAR-3和ES-2细胞中均为高表达（分别为1.218±0.112，1.111±0.084，1.057±0.148，和0.968±0.055）；激光共聚焦显微镜观察到WAVE1与肌动蛋白均共表达于卵巢癌细胞的细胞质和细胞膜上。结论：WAVE1在EOC组织和细胞中均呈现高表达。高水平WAVE1与EOC分期、肿瘤分化、血浆Ca-125值和术后残余瘤有关。WAVE1的高表达与EOC侵袭和不良预后有关，提示WAVE1可能在EOC恶性行为中发挥重要作用。第二部分WAVE1基因特异性shRNA慢病毒载体的构建及稳定转染上皮性卵巢癌细胞株的筛选目的：应用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术设计构建WAVE1的短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体，构建筛选稳定转染卵巢癌细胞株，为后续研究奠定基础。方法：（1）设计并化学合成两对含高效的靶向WAVE1基因的重组质粒和阴性对照。通过双酶切实验和DNA测序法对重组质粒进行鉴定。（2）将经测序验证正确的重组质粒及慢病毒包装质粒，通过Lipofectamine TM2000共转染到293T细胞后收集、提纯、测定滴度。采用慢病毒载体转染法转染至SKOV3细胞中，并建立稳定转染细胞株。（3）采用Western blot法和Real time PCR法分别检测未转染组、阴性对照组及转染组细胞中WAVE1蛋白和mRNA表达量的变化，验证和筛选WAVE1基因抑制效应显著的稳定转染细胞株。结果：（1）成功设计并合成两条WAVE1特异性shRNA，双酶切实验和DNA测序报告显示，基因重组技术成功构建WAVE1基因RNA干扰慢病毒载体，测定滴度为2.2×108U/ml。（2）慢病毒载体介导的WAVE1-shRNA1、WAVE1-shRNA2和阴性对照成功转染SKOV3细胞，采用嘌呤霉素成功筛选获得稳定表达的单克隆细胞株。（3）通过Western blot法与Real time PCR法检测、验证和筛选，获得WAVE1基因抑制效果显著的稳定转染EOC细胞株SKOV3-Ri1细胞。结论：成功靶向构建了WAVE1基因的特异性重组质粒。利用慢病毒载体成功筛选获得了WAVE1基因抑制效果显著的卵巢癌稳定转染细胞株，为进一步研究WAVE1恶性生物学行为及其分子机制奠定实验基础。第三部分慢病毒介导的WAVE1基因沉默对上皮性卵巢癌细胞恶性行为的影响目的：探讨WAVE1基因沉默后对SKOV3细胞生长、增殖、粘附和侵袭等恶性生物学行为的影响。方法：（1）采用激光共聚焦显微镜观察WAVE1基因沉默前后SKOV3细胞的形态学改变。（2）Transwell小室检测WAVE1基因沉默前后SKOV3细胞的迁移、侵袭能力变化。（3）细胞粘附实验分析WAVE1基因沉默前后SKOV3细胞的粘附功能改变。（4）MTT比色法测定WAVE1基因沉默前后SKOV3细胞的增殖能力改变。（5）软琼脂克隆形成实验观察WAVE1基因沉默前后SKOV3细胞的群体依赖性和增殖能力变化。（6）裸鼠皮下移植瘤实验观察WAVE1基因沉默前后SKOV3细胞的成瘤能力变化。结果：（1）干扰WAVE1表达能够使EOC细胞形态发生变化：激光共聚焦显微镜观察到，与阴性对照组和正常对照组相比，干扰组SKOV3-Ri1细胞呈现去极化，丝状伪足、片状伪足形成能力显著减弱，形态变圆。（2）干扰WAVE1表达能够抑制EOC细胞侵袭转移能力：Transwell小室迁移实验结果显示，与阴性对照组和正常对照组相比，干扰组SKOV3-Ri1细胞穿过聚碳酸脂膜的迁移细胞数显著减少（P<0.05）。Transwell小室侵袭实验结果显示，与阴性对照组和正常对照组相比，干扰组SKOV3-Ri1细胞穿过Matrigel的侵袭细胞数显著减少（P<0.05）。细胞粘附实验显示，与阴性对照组和正常对照组相比，干扰组SKOV3-Ri1细胞的粘附能力显著降低（P<0.05）。（3）干扰WAVE1表达能够抑制EOC细胞生长增殖的恶性程度：MTT法检测EOC细胞的增殖结果显示，与阴性对照组和正常对照组相比，在转染后1d、2d、3d、4d和5d，干扰组SKOV3-Ri1细胞生长曲线较平缓，细胞生长速度明显减缓（P<0.05）。软琼脂克隆形成实验显示，与阴性对照组和正常对照组相比，干扰组SKOV3-Ri1细胞细胞生长速度变慢，克隆形成数目显著减少（P<0.05）。（4）干扰WAVE1表达能够抑制裸鼠皮下成瘤的恶性行为能力：与阴性对照组相比，干扰组移植瘤成瘤能力显著减弱，瘤体生长速度缓慢，体积减小。结论：WAVE1基因沉默后改变了卵巢癌细胞SKOV3的形态变化，显著抑制了SKOV3细胞的增殖能力和侵袭转移能力，反向证实了WAVE1在EOC增殖和侵袭转移恶性行为中的作用，具有作为EOC预防、治疗基因靶点的潜在价值。第四部分WAVE1参与上皮性卵巢癌恶性行为的分子机制研究目的：探讨WAVE1参与上皮性卵巢癌增殖和侵袭转移恶性行为的可能分子机制。方法：（1）采用HE染色观察裸鼠移植瘤组织形态学变化。（2）采用免疫组织化学法和Western blot法检测干扰组与阴性对照组移植瘤组织中与增殖、侵袭转移相关蛋白cyclin D1、VEGF、MMP-2、MMP-9和E-cadherin的水平变化。（3）采用Western blot法检测WAVE1基因沉默前后卵巢癌细胞中与增殖、侵袭转移相关信号转导通路蛋白AKT与p-AKT，p38MAPK与p-p38MAPK，ERK1/2与p-ERK1/2蛋白表达水平变化。结果：（1）HE染色后可见，SKOV3-NC组肿瘤细胞失去极性，排列不规则，而SKOV3-Ri1组细胞可见极性，排列相对整齐。（2）免疫组织化学及Western blot结果均显示，与SKOV3-NC相比，SKOV3-Ri1移植瘤组织中cyclin D1、VEGF、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低，而E-cadherin表达水平上升（P<0.05）。（3）Western blot法检测信号转导通路相关的蛋白结果显示，SKOV3-Ri1细胞中AKT蛋白、p-AKT蛋白及p-p38MAPK蛋白显著低于阴性对照组SKOV3-NC细胞（P<0.05）。而两组中ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白及p38MAPK蛋白无明显改变（P>0.05）。结论：在EOC细胞中，上调的WAVE1可能通过激活PI3K/AKT和p38MAPK信号转导通路，介导其下游肿瘤相关基因参与EOC的恶性行为。WAVE1有可能是PI3K/AKT和p38MAPK信号转导通路潜在的调节因子。