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目的:本课题旨在研究汉防己甲素(Tetrandrine, Tet)、雌激素受体抑制剂托瑞米芬(Toremifene, Tor)单独及联合应用对人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02表达P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的多药耐药基因(mdr1)mRNA、抗凋亡基因Survivin mRNA表达的影响,以探讨它们逆转多药耐药的作用机理,为汉防己甲素和雌激素受体抑制剂托瑞米芬作为耐药逆转剂的临床应用提供理论依据。
方法: (1)采用甲基四唑蓝法(MTT)法检测 Tor (2.5μmol/L)及Tet(1μmo/L)单独及联合作用于K562细胞和K562/A02细胞一定时间阿霉素(ADM)对细胞的半数抑制量；(2)采用半定量PCR(RT-PCR)法检测K562细胞,Tor(2.5μmol/L)及Tet(1μmo/L)单独及联合作用于K562/A02细胞一定时间多药耐药基因(mdr1基因)mRNA表达水平、抗凋亡基因Survivin mRNA表达水平；(3)采用流式细胞仪(FCM)检测K562细胞,Tor(2.5μmol/L)及Tet(1 μmo/L)单独及联合作用于K562/A02细胞一定时间细胞膜上P-gp的表达、细胞内ADM浓度、细胞的凋亡率。
结果 :(1)逆转剂处理前后ADM对K562细胞和K562/A02细胞的毒性作用：①K562/A02、K562细胞IC50值分别为57.43±4.55mg/L和1.16±0.05 mg/L;②Tor及Tet单独及联合处理对K562细胞IC50值无明显影响；③Tor及Tet单独处理K562/A02细胞的IC50值分别为20.74±1.62 mg/L和14.12±1.20 mg/L,两药联合其IC50值降为9.14±1.03mg/L：(2)对照组K562/A02细胞48h凋亡率为2.20±0.04％,经1mg/L的ADM作用48h后凋亡率为2.69±0.05％；Tor(2.5μmo/L、Tet(1μmo/L)、Tor(2.5μmo/L)联合Tet(1μmo/L),与ADM共同作用48h后,凋亡率分别为12.10±1.10％、19.10±1.20％和61.10％±0.80％； (3)RT-PCR检测细胞mdrl mRNA的表达：①K562细胞mdrl mRNA表达为阴性,K562/A02细胞mdrl mRNA表达为阳性；②K562/A02细胞的空白对照组mdrl/β-actin为1.398±0.031,Tet组为0.923±0.044,Tor为1.112±0.029,两药联合组为0.3894±0.062,Tet及Tor单独作用后K562/A02细胞mdrl mRNA下调微弱,联合用药下调效果明显(P<0.05);(4)FCM检测细胞膜P-gP的表达水平的变化:K562细胞、K562/A02细胞P-gP荧光强度分别为1.12及98.04。后者经Tet、Tor及Tet和Tor联合作用48h后,P-gp荧光强度分别为81.18、82.60和63.93。Tet及Tor处理过的K562/A02细胞P-gP蛋白的荧光强度下调,两药联合下调更明显,具有协同作用(P<0.05);(5)FCM检测细胞内ADM浓度：①K562/A02细胞内ADM浓度为K562细胞的13.40％；②K562/A02经Tet、Tor及两药联合作用48h,细胞内ADM浓度分别为K562细胞的35.36％、21.82％和48.62％。Tet处理组及Tet联合Tor处理组,细胞内ADM浓度明显增加,与K562/A02对照组间有显著性差异(P<0.05)。(6)RT-PCR检测细胞Survivin mRNA的表达：①K562细胞、K562/A02细胞Survivin mRNA表达均为阳性,但K562/A02细胞的表达水平有所上调；②K562/A02细胞的空白对照组、Tet组、Tor组、两药联合组的Survivin/β-actin分别为1.414±0.025、0.982±0.041、0.886±0.024和0.459±0.029,Tet及Tor单独作用后K562/A02 Survivin mRNA下调微弱,联合用药下调效果明显(P<0.05)。
结论:(1)有效逆转浓度的Tet及Tor均可下调耐药细胞表面P-gP的表达、促进ADM进入细胞内,提高细胞内ADM浓度以杀死K562/A02细胞：(2)有效逆转浓度的Tet及Tor均可下调K562/A02细胞mdrl mRNA、Survivin mRNA的表达；(3)有效逆转浓度的Tet及托瑞米芬均可逆转耐药,且联合作用效果增强。