山鸡椒(Litsea cubeba(Lour.)Pers)是我国重要的天然香料树种,以果实为主要原料提取的山鸡椒精油在化工业、农业、制药业等行业有广泛应用,供不应求。山鸡椒精油主要成分萜类物质的合成途径及关键基因暂不清楚,萜类合成通路关键酶的研究可以为品种的遗传改良提供基因资源。山鸡椒精油以单萜与倍半萜为主要活性物质,目前在山鸡椒萜类合成通路上已陆续有关键酶基因被克隆鉴定,但其中具有竞争性关键调控作用的异戊烯基转移酶(IPS)尚缺乏了解。本研究基于山鸡椒果实发育过程的转录组数据,鉴定了来自LcIPS三个基因家族共14条基因,对这14条基因进行了表达模式分析;在此基础上,挑选来自山鸡椒香叶基二磷酸合酶(LcGPPS)家族与山鸡椒香叶基香叶基二磷酸合酶(LcGGPPS)家族的4条基因进行了序列分析与蛋白表达分析;并对来自两个家族的蛋白之间的互作关系进行了预测与验证,研究结果为深入阐明山鸡椒精油合成的调控机制,提高品质和产量提供了理论基础,主要研究结果如下:(1)山鸡椒LcIPS三个家族基因的鉴定与表达模式分析。依据山鸡椒果实发育过程的转录组数据,寻找到分别来自香叶基焦磷酸合酶基因(GPPS)、法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)与香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS)家族共14条基因,以山鸡椒各组织及不同发育时期的果实RNA反转录的cDNA为模板分析这14条基因的表达模式,经分析,14条LcIPSs都有其独特的表达模式,每个家族都有至少一个基因发挥着主要作用。在LcFPPS家族里,LcFPPS2在果实发育过程中呈现出显著的表达高峰。在LcGPPS家族里,我们发现了同质体与异质体两类蛋白,其中属于异质体小亚基的LcGPPS.SSU1在果实发育过程中出现显著的表达高峰。在LcGGPPS家族中,LcGGPPS1参与较多组织中萜类物质的生成,LcGGPPS2的作用更具特异性,LcGGPPS3-7在花和果实的发育过程中萜类物质的合成都起着作用,LcGGPPS6在果实发育过程中的表达趋势并没有明显的规律,其余6条基因在果实发育过程中都展现出特异的作用时期。(2)分离LcGPPS1、LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1与LcGGPPS3基因,进行序列分析和理化性质预测。LcGPPS1的ORF为966bp,编码321个氨基酸;LcGPPS.SSU1的ORF包含897bp,编码298个氨基酸;LcGGPPS1和LcGGPPS3基因的ORF均为1152bp,编码383个氨基酸。ExPASy预测显示LcGPPS1、LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1、LcGGPPS3蛋白的相对分子量分别为34.97、32.21、41.39、41.49 kDa,理论等电点pI分别为5.43、5.33、5.86、5.87,蛋白的分子式分别为C1535H2499N421O477S15、C1413H2279N395O431S16、C1828H2960N504O551S18、C1820H2926N510O554S21。对4个蛋白进行亚细胞定位预测显示,LcGPPS1定位于细胞核中,LcGPPS.SSU1可能定位于叶绿体或细胞质中,LcGGPPS1和LcGGPPS3都有最高的可能性位于线粒体内。(3)通过真核与原核外源表达系统进行LcGPPS1、LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1与LcGGPPS3重组蛋白表达分析。通过构建真核分泌表达载体转化毕赤酵母,甲醇诱导表达后,发现4个重组蛋白都以单体和二聚体的形式主要存在于菌体中,较少分泌到细胞外。对表达产物进行镍柱纯化时,得到LcGGPPS3在毕赤酵母里表达的重组蛋白。进一步构建原核表达载体pET28a-LcGGPPS1与pET28a-LcGPPS.SSU1,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)与Rosetta菌株,IPTG诱导表达后经螯合SFF(Ni)柱纯化得到LcGGPPS1重组蛋白。(4)通过三维结构预测和酵母双杂验证LcGPPS.SSU1分别与LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作关系。进化关系分析发现LcGGPPS1与LcGGPPS3都没有聚类到LSU类别,且LcGGPPS3与大部分GGPPS都相距较远。在LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1与LcGGPPS3的三维结构中都包含一个GPPS核心保守区域,GPPS核心组成了LcGPPS.SSU1大部分结构。且根据预测LcGGPPS1与LcGGPPS3都可以与LcGPPS.SSU1进行互作。酵母双杂实验表明,LcGGPPS3能够与LcGPPS.SSU1进行蛋白互作,但显示互作较弱;LcGGPPS1则不能与LcGPPS.SSU1互作。