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由于臭氧层的破坏使到达地表的中波紫外线（UVB）显著增加,可引起人类皮肤炎、皮肤老化、免疫抑制及皮肤癌等,还可对地球上的其他动植物造成危害,因此,UVB对生物体的损伤作用逐渐成为人们的关注热点。研究发现紫外线引起角质形成细胞损伤的过程可以激活免疫系统中的Toll样受体（toll-like receptor,TLRs）,进而激活NF-κB信号通路,引起炎症因子释放。UVB辐射还可导致大量活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的产生和积累,引起机体中的组织和细胞发生脂质过氧化,引起ERK1/2、p38 MAPK、JNK和NF-κB等信号通路的异常激活。Resatorvid（TAK-242）是NF-κB上游信号分子TLR4的特异性抑制剂;维生素D的活性形式可通过NF-κB和PI3K信号通路调节促炎和抗炎因子及免疫细胞发挥抗炎作用,还可以调节与细胞的程序性死亡有关的Bcl-2家族蛋白、FADD和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）表达。目的:明确骨化三醇（1,25（OH）2D3）和TAK-242联合应用对UVB所致HaCaT细胞损伤的防护作用,并分析探讨其作用机制。方法:体外培养HaCaT细胞,给予不同剂量的UVB照射,继续培养24h后,采用MTT法检测细胞存活率,确定本实验UVB照射剂量;给予不同浓度的1,25（OH）2D3预处理24h后,再给予不同浓度的TAK-242预处理1h,UVB照射24h后,经MTT法检测,确定本实验1,25（OH）2D3和TAK-242处理浓度。将HaCaT细胞分为7组:正常组不做任何处理;1,25（OH）2D3组单独给予1,25（OH）2D3作用24h;UVB组单独给予UVB照射;TAK-242组单独给予TAK-242作用1h;TAK-242+UVB组给予TAK-242预处理1h,然后给予UVB照射;1,25（OH）2D3+UVB组给予1,25（OH）2D3预处理24h,然后给予UVB照射;1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组给予1,25（OH）2D3预处理24h,然后TAK-242预处理1h,再给予UVB照射。不同药物预处理组经UVB照射,继续培养24h。采用HE染色法观察细胞形态;DAPI染色检测细胞凋亡情况,Annexin-V-PE细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡水平;Western blot法检测Caspase-8、Caspase-3、Cytc凋亡蛋白表达情况;采用细胞划痕法检测各组细胞的迁移能力;采用活性氧检测试剂盒对细胞内生成的ROS进行检测;Western blot法检测NF-κB、TLR4、PI3K、IκBα、P-IκBα、Bip、PERK、P-PERK氧化应激和内质网应激蛋白的表达情况。采用IBM-SPSS24.0进行统计分析。结果:1.照射剂量和药物处理浓度的确定（1）UVB照射剂量确定:经UVB照射,HaCaT细胞的存活率随着UVB照射剂量的增大而逐渐降低,与正常组比较,UVB照射剂量为5mJ/cm2、10mJ/cm2、15mJ/cm2、20mJ/cm2、25mJ/cm2、30mJ/cm2、35mJ/cm2、40mJ/cm2、45mJ/cm2组细胞的存活率显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。UVB照射剂量为20mJ/cm2时,细胞存活率为55.61%,且与其他剂量组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。因此本实验确定20mJ/cm2作为UVB的辐照剂量。（2）骨化三醇（1,25（OH）2D3）浓度确定:经过不同浓度1,25（OH）2D3处理的HaCaT细胞,在相同UVB照射剂量下,细胞的存活率随着处理浓度的增加先升高而后降低,浓度为100nM的1,25（OH）2D3处理组与其他剂量处理组比较,细胞存活率显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。因此本实验确定100nM为1,25（OH）2D3处理浓度。（3）TAK-242浓度确定:在相同UVB照射剂量下,HaCaT细胞的存活率随着TAK-242处理浓度的增加先升高而后降低,浓度为2μM的TAK-242处理组与其他浓度处理组比较,细胞的存活率显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。因此本实验确定2μM为TAK-242的处理浓度。2.细胞形态变化正常组、1,25（OH）2D3组及TAK-242组细胞经HE染色后,细胞膜细胞核染色均匀,胞膜胞核完整,极少可见细胞核碎裂,细胞膜破裂,细胞结构轮廓不清,可见细胞密度均匀,活细胞密度未出现明显降低;UVB组细胞内出现明显的细胞膜破裂,核碎裂的现象,细胞结构轮廓不清,活细胞的密度出现明显降低;与UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组、TAK-242+UVB组及1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组部分出现细胞膜破裂,核碎裂,细胞结构轮廓不清,活细胞的密度降低的现象。3.细胞凋亡情况正常组细胞经DAPI染色后,胞核均匀淡染,胞膜完整,细胞贴壁良好,呈多角形或梭形;与正常组比较,UVB组细胞贴壁数量明显变少,细胞变圆,间隙变大,胞膜破损,核碎裂,出现明显的凋亡特征,可见凋亡小体的形成;与UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组、TAK-242+UVB组及1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组部分出现细胞破损,核碎裂及凋亡小体现象。4.细胞迁移能力变化与UVB照射组比较,正常组及其他处理组别的细胞在划痕12h和24h后,细胞划痕的相对愈合宽度均显著高于UVB组,差异具有统计学意义（P<0.05）;划痕12h后,与其他处理组比较,单独给予1,25（OH）2D3处理组的细胞划痕相对愈合宽度显著升高,差异具有统计学意（P<0.05）;划痕1224h期间,与其他处理组比较,单独给予TAK-242处理组的细胞划痕相对愈合宽度显著升高,差异具有统计意义（P<0.05）;在划痕12h和24h后,1,25（OH）2D3+UVB组和1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞划痕相对愈合宽度均高于TAK-242+UVB组,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.细胞活性氧水平与正常组比较,所有经UVB照射组别的细胞内产生ROS的水平显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与UVB组比较,TAK-242+UVB组细胞内产生ROS的水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与TAK-242+UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组细胞内产生ROS的水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与1,25（OH）2D3+UVB组和TAK-242+UVB组比较,1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞内产生ROS的水平降低最为显著,差异具有统计学意义（P<0.05）。6.细胞凋亡水平与正常组比较,所有经UVB照射组别内的细胞凋亡水平显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;而与UVB组细胞比较,1,25（OH）2D3+UVB组、TAK-242+UVB组和1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组的细胞凋亡水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;1,25（OH）2D3+UVB组、TAK-242+UVB组、1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组三组之间细胞凋亡水平比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7.氧化应激相关蛋白表达水平与正常组比较,UVB组细胞TLR4、NF-κB蛋白表达水平及P-IκBα/IκBα的比值出现显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与正常组比较,UVB组细胞IκBα、PI3K蛋白的表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与正常组比较,1,25（OH）2D3组细胞NF-κB蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与正常组比较,TAK-242组细胞TLR4蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组、TAK-242+UVB组及1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞TLR4、NF-κB蛋白表达水平及P-IκBα/IκBα的比值显著降低,IκBα、PI3K蛋白的表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。8.内质网应激相关蛋白表达水平与正常组比较,UVB组细胞P-PERK、Bip蛋白表达水平及P-PERK/PERK比值显著升高,差异具有统计学意义P<0.05);与正常组比较,UVB组细胞PERK蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组、TAK-242+UVB组、1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞P-PERK、Bip蛋白表达水平及P-PERK/PERK比值显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与TAK-242+UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组和1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞Bip蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。9.细胞凋亡相关蛋白表达水平与正常组比较,UVB组细胞Cytc、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组细胞Caspase-3和Cytc蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与UVB组比较,TAK-242+UVB组和1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞Cytc、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与TAK-242+UVB组比较,1,25（OH）2D3+UVB组和1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞Caspase-3和Cytc蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与1,25（OH）2D3+UVB组和TAK-242+UVB组比较,1,25（OH）2D3+TAK-242+UVB组细胞Cytc、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达水平降低最为显著,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.UVB可以导致细胞内ROS水平升高,细胞迁移能力降低,引起氧化应激和内质网应激,细胞凋亡水平升高;2.1,25（OH）2D3与TAK-242联合处理减少细胞内ROS产生的效果优于单独处理;3.1,25（OH）2D3和TAK-242预处理后减轻UVB引起的细胞损伤,改善细胞迁移能力;4.1,25（OH）2D3和TAK-242预处理后可以通过抑制NF-κB的激活来减轻UVB致HaCaT细胞的损伤作用;5.1,25（OH）2D3和TAK-242联合处理后可以通过降低Cytc、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达水平,减少细胞凋亡,效果优于单独处理。