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4-脯氨酸羟化酶（Prolyl 4-hydroxylases,P4Hs）是一类重要的依赖于亚铁离子和2-酮戊二酸的氧化酶（Ferrous iron and 2-oxoglutarate-dependent oxygenases）,广泛存在于真核生物及部分原核生物中,可以利用亚铁离子作为辅因子,在氧气的参与下,羟基化含有脯氨酸的多肽底物,同时对辅因子2-酮戊二酸进行脱羧,生成琥珀酸和二氧化碳。P4Hs催化的羟基化反应在多种生命过程中发挥重要作用,如参与脊椎动物胶原蛋白的合成、核酸分子的修复、调节相关基因的转录和翻译,甚至还可以参与到植物及细菌生长过程中次级代谢产物和信号分子的生物合成。辣椒疫霉是一种危害极大的植物病原卵菌,可侵染多种经济性作物,对农业生产造成极大的损失。羟基脯氨酸是疫霉细胞壁的重要组成成分,含有羟基脯氨酸的激发子蛋白,在病原菌与寄主植物互作过程中起重要作用,所以研究辣椒疫霉中脯氨酸羟化酶在菌体生长、发育,甚至致病过程中的生物学功能,可能会为筛选辣椒疫霉新的化学杀菌剂提供靶标。通过生物信息学分析,我们在辣椒疫霉基因组中获得5个假定的PcP4Hs基因,命名为PcP4H1-5,并进行了PcP4Hs生物学功能和蛋白质结构分析。具体总结如下:1、通过生物信息学分析,从辣椒疫霉标准菌株LT1534中获得5个PcP4Hs基因,命名为PcP4H1-5,其在低氧环境中表达量都表现出不同程度的下降,而且PcP4H1表达量显著下调;PcP4H2-5在不同发育时期和侵染时期表达量变化较小,但是PcP4H1在侵染初期表达量显著上调;2、通过原核表达系统获得PcP4H1蛋白质晶体,成功解析结构,分辨率为2.35?。PcP4H1空间群为P1,每个不对称单元中含有两个分子,每个分子中含有一个保守的DSBH中心结构域。亚铁离子和2-酮戊二酸位于DSBH围成的活性口袋内,前者与高度保守的H155-X-D157…H214基序结合,后者可能与保守的Arg223、Thr227和Trp229直接或间接结合。βⅡ-strand、α9-helix和βⅡ-βⅢthumb loop共同围成底物结合凹槽,活性口袋位于底物结合凹槽的中心位置;松散且较长的β2-β3 loop、C-端α9-α10loop和βⅡ-βⅢthumb loop可能共同决定底物的特异性结合和结合模式。与其它脯氨酸羟化酶结构相比较,PcP4H1活性口袋空间更大更深,可能使其结合更复杂的小分子辅因子;PcP4H1结构中还包含独特的C-端α-helices,除了可能参与底物结合,还可能承担其它的生物学功能;3、PcP4H1与辅因子的二元复合物结构:选取分子结构类似于2-酮戊二酸的酶活性抑制剂小分子:N-oxalylglycine、Pyridine-2,4-dicarboxylic acid和Dimethyloxalylglycine作为辅因子。采用蛋白和小分子共同孵育后培养复合物晶体及小分子直接socking野生型PcP4H1蛋白晶体两种方法,获得复合物晶体,进行X-射线衍射,收集衍射数据,解析结构,分析小分子结合方式。成功获得PcP4H1-NOG二元复合物结构,NOG取代2OG结合在PcP4H1催化活性中心,与Fe2+形成双配位,与Thr227侧链直接以氢键结合,并通过水分子与Arg223侧链之间以氢键间接结合,使NOG稳定结合在活性中心;4、成功获得2个辣椒疫霉PcP4H1沉默转化子SiPcP4H1-1和SiPcP4H1-2。SiPcP4H1-1和SiPcP4H1-2菌丝生长较为缓慢,菌落、菌丝和孢囊梗形态无明显变化,孢子囊由梨形变为球形。SiPcP4H1-1和SiPcP4H1-2对寄主侵染阶段的影响正在试验中。PcP4H1-1可能参与菌丝及孢子囊的生长发育。综上所述,我们从辣椒疫霉菌中获得了5个脯氨酸羟化酶基因PcP4H1-5,PcP4H1可能参与到辣椒疫霉的生长发育及其与寄主植物的互作过程。三维结构表明,PcP4H1含有经典的DSBH核心结构域,亚铁离子和辅因子位于空间更大的活性口袋内,松散的β2-β3 loop、C-端α9-α10 loop和βⅡ-βⅢthumb loop可能参与形成底物结合通道,并决定底物结合的特异性,推导出假定的底物结合改变PcP4H1三维构象的模型。酶活力检测表明PcP4H1不能或只能微弱羟基化现有P4Hs的多肽底物,下一步,我们将试图获得PcP4H1在辣椒疫霉菌体内的的特异性底物,或者互作蛋白,进一步探索PcP4H1可能的生物学功能,并进行酶-底物复合物晶体筛选和结构解析。目前来说,PcP4H1结构的解析可能为筛选P4Hs新型抑制剂提供新的思路,为进一步理解P4Hs结构特性提供理论基础。与高等生物P4Hs结构同源性分析表明,P4Hs也可能在进化上来源于更古老的生物。