研究背景本研究是国家自然基金(87214153)及教育部博士点基金(20130013120001)的部分研究内容,并得到了北京中医药大学自主选题项目(2013-JYB22-XS-086)资助。菊苣系维吾尔族习用药材,为菊科植物毛菊苣Cichorium glandulosum Boiss.et Huet或菊苣Cichorium intybus L.的干燥地上部分或根,具有清肝利胆,健胃消食,利尿消肿的作用。现代研究表明,菊苣具有降血糖、降血脂、降尿酸、保肝等药理作用。因此,菊苣具有很好的应用前景及开发前景。然而,课题组前期研究中发现菊苣药材市场较为混乱,市场上存在着较多的伪品及劣品,这极大的影响了菊苣临床应用的安全性和有效性。2010版《中国药典》中菊苣质量评价内容包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别、浸出物含量测定等,然而仅用这些方法较难准确的评价市场上菊苣药材的真伪与质量。菊苣药材质量评价研究的重要性日益突出,这对于保证课题组各项研究工作的顺利开展、菊苣临床应用的安全性至关重要。课题组前期已开展了菊苣根的质量评价研究,而菊苣地上部分药材质量评价研究尚未展开。本论文开展菊苣地上部分药材质量评价研究,对保证课题组各项研究工作顺利开展、菊苣地上部分药材临床应用的有效性和安全性及菊苣资源的开发利用有着重要的现实意义。研究内容研究内容包括文献综述和实验研究两部分。(一)文献综述综述一菊苣药材质量评价的研究进展本部分内容从性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别、红外光谱鉴别、有效成分含量测定、HPLC指纹图谱、农残及重金属含量测定等多方面对菊苣药材的质量评价方法进行了文献回顾。综述二中药质量评价方法的研究进展本部分内容对中药传统的质量评价方式、基于化学成分含量测定的质量评价方式、基于指纹图谱的质量评价方式、基于生物测定的质量评价方式、基于TLC生物自显影技术的质量评价方式进行了比较系统的文献回顾,为菊苣地上部分药材质量评价方法的选择打下基础。综述三HPLC指纹图谱与rDNA-ITS序列在中药质量评价中的应用进展本部分内容分别介绍了 HPLC指纹图谱和rDNA-ITS序列在中药质量评价中的应用,为菊苣地上部分药材质量评价的展开打下基础。(二)实验研究菊苣地上部分药材的质量评价从真伪/品种鉴别和品质评价两方面着手。真伪/品种鉴别方面进行了常规的鉴别研究,并展开了菊苣药材的rDNA-ITS序列研究。品质评价包括两部分内容,分别为菊苣地上部分药材的HPLC指纹图谱研究和菊苣地上部分药材中化学成分的定量研究。第一部分菊苣地上部分药材的鉴别研究实验一菊苣地上部分药材的一般鉴别目前,菊苣的常规鉴别方法包括性状鉴别、显微鉴别及TLC鉴别三种方法,这三种方法能对菊苣原药材进行很好的鉴别。然而,市场上存在的菊苣药材并不具备原药材的所有特征,其能否利用这三种方法的一种或几种准确鉴别真伪/品种呢?本实验针对这个问题,分别展开了菊苣地上部分药材的性状鉴别研究、显微鉴别研究和TLC鉴别研究。实验二菊苣地上部分药材的rDNA-ITS序列研究本实验对全国14个省市的菊苣样本,采用PCR扩增以及测序技术进行了 rDNA-ITS序列的测定,并采用DNAMAN和SPSS软件对菊苣ITS序列进行了分析,为菊苣的资源鉴定、品种识别提供精准的方法。第二部分菊苣地上部分药材的HPLC指纹图谱研究实验三菊苣地上部分药材的HPLC指纹图谱研究本实验采用HPLC法构建了全国14个产地17批菊苣及毛菊苣地上部分样品的指纹图谱,并对样品的HPLC图谱数据进行了相似度评价、聚类分析(Cluster Analysis,CA)和主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),为菊苣地上部分药材质量的整体控制和评价提供依据。第三部分菊苣地上部分药材中化学成分的定量研究实验四菊苣地上部分药材中菊苣酸、绿原酸的含量测定研究菊苣酸、绿原酸是菊苣地上部分药材中的重要化学成分。本实验对能反映菊苣资源分布的全国13个产地15批菊苣及毛菊苣药材,建立了利用HPLC同时分析菊苣酸和绿原酸含量的方法,为菊苣地上部分药材的质量评价提供实验依据。实验五菊苣地上部分药材中菊苣多糖的含量测定研究大量研究表明菊苣多糖是菊苣药材中的重要大分子化学成分。本实验测定了 15批菊苣及毛菊苣地上部分药材中菊苣多糖含量,并比较了各批药材中菊苣多糖的含量差异,为中药菊苣的质量评价提供参考。研究结果1、性状鉴别、显微鉴别、TLC鉴别为菊苣的真伪鉴定和品种鉴别提供了简便易行的方法。然而,性状及显微鉴别均存在主观性强而可操作性差的局限。薄层色谱法(TLC)能够有效的鉴定菊苣的真伪,但由于菊苣和毛菊苣化学成分的相似性,目前TLC法还不能很好的鉴别菊苣的品种。2、菊苣和毛菊苣完整的ITS序列长度范围为640-641 bp,ITS-1为255bp,5.8SrDNA为163bp,ITS-2为223-224bp,共有13个碱基位点发生了变异。菊苣ITS序列种内相似度都在99.1%以上,毛菊苣ITS序列种内相似度在99.8%以上,而两品种间ITS序列相似度在99.2%以下。菊苣两个品种的ITS序列在第61、69、141、209、228bp位置上,碱基存在不同程度的转换和颠换,且这种转换和颠换在同一物种内相对稳定。3、建立了菊苣地上部分药材的HPLC指纹图谱,HPLC指纹图谱共有17个共有峰。11批菊苣样本与菊苣对照图谱的相似度都大于0.874,6批毛菊苣样本与毛菊苣对照图谱的相似度均大于0.914。聚类分析和主成分分析实现了菊苣和毛菊苣HPLC指纹图谱差异的识别。4、菊苣地上部分药材中菊苣酸的含量在2.370～6.217 mg/g之间,毛菊苣地上部分药材中所含的菊苣酸含量仅在0.127～0.954 mg/g之间。不同产地同一品种菊苣地上部分药材中菊苣酸含量相对稳定。菊苣地上部分药材中绿原酸的含量在0.215～0.512 mg/g之间,毛菊苣地上部分药材中所含的绿原酸含量仅在0～0.954 mg/g之间。5、全国各产地菊苣和毛菊苣地上部分药材中菊苣多糖的含量差异不大,其在不同样品中的含量范围为2.593～7.075 mg/g之间,较为稳定。研究结论1、菊苣地上部分药材的质量评价研究首先要鉴别真伪/品种,传统鉴别方法和DNA分子鉴定各有优势和不足。在鉴别菊苣地上部分药材的实践中,需将传统鉴别方法与DNA分子鉴定有机结合起来,实现优势互补的作用。2、各产地菊苣和毛菊苣地上部分药材与同品种菊苣对照图谱相似度较大,且HPLC指纹图谱能够较好的反映菊苣地上部分药材小分子化学成分的“全貌”,因此,HPLC指纹图谱可以较好的用于菊苣地上部分药材的品质评价。在菊苣地上部分药材质量评价的实践中,可要求样品的HPLC指纹图谱在对应的保留时间点出现17个特征峰,并且各特征峰的相对峰面积需在合适范围内。3、菊苣酸和绿原酸是菊苣的重要化学成分,它们在菊苣地上部分药材中也相对稳定,因此,菊苣酸和绿原酸含量可以较好反映菊苣地上部分药材质量。在菊苣地上部分药材质量评价的实践中,可要求菊苣(Cichorium intybus L.)样品中菊苣酸含量不小于2.0 mg/g、绿原酸含量不小于0.2mg/g。菊苣多糖能够较好的反映菊苣药材中大分子成分含量,菊苣多糖的含量测定对评价菊苣地上部分药材的质量也至关重要。实验过程中菊苣和毛菊苣地上部分药材中菊苣多糖的含量较为稳定,在菊苣地上部分药材质量评价的实践中,可要求菊苣和毛菊苣地上部分药材中菊苣多糖含量不小于2.0 mg/g。