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天然免疫系统作为机体抵抗病原微生物的关键防线之一,主要是通过天然免疫细胞的模式识别受体(pattern-recognition receptor,PRR)识别病原微生物的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)和自身来源的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)。目前已知的天然免疫受体主要包括Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)、RIG-I样受体(retinoid acid-inducible gene-I,RLRs)、NLR样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)、CLR样受体(C-type lectin receptors,CLRs)和DNA识别受体等。多种天然免疫识别受体识别释放到胞内的病原核酸(DNA和RNA),其中参与识别DNA的受体主要包括TLR9、环鸟苷-腺苷二磷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)、AIM2(absent in melanoma 2)和干扰素诱导蛋白16(inteferon inducible protein,IFI16)等。模式识别受体介导DNA识别后,激活天然免疫应答信号通路,最终诱导Ⅰ型干扰素(IFN)和促炎性细胞因子表达,杀伤并清除入侵的病原体。c GAS是目前研究最多的,也最被认可的细胞内DNA感受器,其调控的c GAS-STING信号通路是机体最经典的DNA应答途径。c GAS能结合各种形式的ds DNA,催化c GAMP的合成同时将信号向下游传递,c GAMP与位于内质网的干扰素诱导基因STING相互结合,促进STING形成二聚体转位到核周附近,活化的STING促进TBK1和IRF3的磷酸化,诱导Ⅰ型干扰素的转录和表达。在c GAS-STING信号通路中,STING作为接头蛋白发挥重要功能,有多种泛素连接酶或去泛素化酶调节STING的泛素化修饰,导致STING降解或影响其活性,进而调控下游信号通路蛋白的激活,维持机体的免疫平衡。泛素化是蛋白质功能调控的重要方式之一,受到E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的泛素化酶系统与去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)系统拮抗调节。泛素化与去泛素化在蛋白质的功能调节中作用广泛且重要,在诸多的免疫过程中也扮演着重要角色。泛素是含有76个氨基酸的小分子多肽,单体分子量为8.6 k Da,通过与目的蛋白以共价键方式相连,从而调控它们的稳态或活性。泛素与底物的结合通常发生在赖氨酸残基上,由于泛素含有7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63),因此产生7种不同类型的多聚泛素链,其中K63泛素化修饰和与蛋白酶体降解相关的K48泛素化修饰的研究最多。目前对于STING的泛素化调控已有一些报导仍有待进一步挖掘和完善。基于前期对STING信号通路的研究,我们通过IP-MS实验鉴定与STING相互作用的E3泛素连接酶,通过分析质谱数据,我们筛选了目前尚未报导的对STING有调控功能的E3泛素连接酶,发现了针对DNA病毒HSV-1具有显著调控功能的E3泛素连接酶复合体组分FBXO11。FBXO11是一种F-box家族蛋白,在调控细胞周期、肿瘤发生和转移发挥着重要作用,但在抗病毒免疫中的功能还没有研究。在本课题的研究中,我们首先明确了FBXO11在抗病毒天然免疫应答中的正向调控效应。在原代巨噬细胞中FBXO11的表达下调,显著抑制了DNA病毒HSV-1诱导下IFN-?、IFN-?4和炎性细胞因子的表达水平,而对RNA病毒VSV诱导的干扰素及炎症因子分泌未发现明显调控效应。双荧光素酶报告基因实验也发现FBXO11能有效增强c GAS-STING诱导的IFN-?荧光素酶报告基因水平的上调,而不能调控TBK1和IRF3以及RNA识别通路中RIG-I和MAVS诱导的IFN-?表达。因此,FBXO11选择性的调控DNA病毒诱导的抗病毒天然免疫应答。在机制研究中,通过Western Blot信号通路分析发现,FBXO11敲低后抑制了c GAS-STING通路中TBK1、IRF3和p65的磷酸化活化,提示FBXO11作用于STING或其上游。免疫共沉淀实验发现,FBXO11与STING相互作用。通过构建FBXO11和STING的截短体实验,证实了FBXO11与STING相互作用依赖于FBXO11的Pb H结构域和STING的C端结构域(C-terminal domain,CTD)。在接下来的实验中,我们阐明了FBXO11通过下调对STING的K48泛素化修饰水平,抑制STING蛋白酶体途径的降解,进而促进STING的二聚化活化。通过构建STING的赖氨酸位点Lys-Arg单点突变质粒,发现STING的K224位点是FBXO11抑制STING泛素化修饰的关键位点,该位点突变后,FBXO11对c GAS-STING诱导的IFN-?荧光素酶报告基因的促进作用消失,对STING降解的抑制效应也消失。然而FBXO11调控STING泛素化降低的具体分子机制仍然需要进一步研究。FBXO11作为E3泛素连接酶复合体组分,没有促进STING的泛素化,反而抑制其泛素化,我们提出了两种可能的机制:(1)FBXO11可以抑制另一种E3蛋白介导STING的K48泛素化修饰。FBXO11通过阻止该E3结合STING,减弱其对STING的K48泛素化修饰,从而间接抑制了STING的降解。(2)FBXO11促进一种DUB结合STING,促进STING去泛素化,从而间接抑制STING的降解。我们将在后续工作中对此进行进一步研究。综上所述,本课题研究发现了E3泛素连接酶FBXO11正向调控天然免疫反应的新功能,验证了抗病毒天然免疫信号通路中关键分子STING的重要作用。FBXO11通过靶向STING的K224位点,去除STING的K48泛素化修饰,维持STING的稳定性,促进机体抗病毒天然免疫应答。本研究为进一步理解FBXO11在肿瘤免疫的抑癌机制提供新思路,为治疗癌症和病毒感染提供了潜在的作用靶点。