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目的胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤,其治疗方案仍主要是手术切除,并结合术后放疗联合替莫唑胺的同步加辅助治疗。但是大部分胶质瘤仍然不可避免的发生复发,尽管国内国际几十种药物通过复发胶质瘤临床试验,但是尚未找到同时提高生存时间和无症状生存期的药物。阿帕替尼作为小分子抗血管生成靶向药物,高度选择性竞争细胞内VEGFR-2的ATP结合位点,阻断下游信号转导。首先在胃癌中获得批准三线用药,效果得到临床认可。在胶质瘤复发患者的临床试验中,阿帕替尼也初见成效。但是阿帕替尼的抗胶质瘤的作用机制尚未完全明了。目前尚未见阿帕替尼对胶质瘤细胞增殖,迁移侵袭能力抑制作用及相关机制的研究报道。本研究旨在探讨阿帕替尼对高级别胶质瘤细胞增殖,迁移侵袭能力的抑制作用及相关机制。方法1.通过MTT法检测了阿帕替尼对患者来源N14069细胞、N14042细胞、细胞增殖的影响,并明确阿帕替尼抑制胶质瘤细胞增殖的半数抑制浓度(IC-50)。2.通过PI-FACS实验探讨250umol/l浓度的阿帕替尼对N14042细胞及N14069细胞细胞周期的作用。3.通过Matrigel小室试验探讨250umol/浓度的阿帕替尼对N14042细胞及N14069细胞迁移侵袭能力的抑制作用。4.给药72小时,通过Trizol法提取给药组及对照组总RNA,通过全转录组芯片生物信息分析法,寻找给药组及对照组中的差异基因。给药组及对照组细胞,通过裂解法提取蛋白,通过等重同位素多标签相对定量蛋白质组学法,寻找两组的差异蛋白。通过联合生信聚合分析,明确RNA和蛋白同时明显下调基因,该阳性基因-THBS1很可能就是促进胶质瘤细胞增殖的驱动基因。5.运用Western-Blot和RT-PCR检测验证THBS1基因在给药组与对照组的蛋白和mRNA的表达差异性。6.设计3种特异性结合THBS1基因片段的基因序列,通过PCR鉴定和测序,合成RNA干扰慢病毒载体。将病毒滴度测定后,分别将三种慢病毒转染至N14069和N14042细胞中及对照组,通过RT-PCR和荧光显微镜检测THBS1的表达情况及敲减效率。选择敲减效率最高的慢病毒,通过细胞周期实验、MTT检测实验、以及侵袭实验探讨下调THBS1后对胶质瘤细胞在增殖及侵袭功能的影响。7.用病毒增强液将载有THBS1基因片段的慢病毒转染至N14042细胞中,同时设立空白及阴性对照组,通过荧光显微镜检测转染前后胶质瘤细胞N14042转染效率。分别加入250umol/l的阿帕替尼培养36小时后,通过细胞周期实验、MTT检测实验、以及侵袭实验探讨上调THBS1后对阿帕替尼对胶质瘤细胞增殖及侵袭功能的影响。结果1.MTT法证明在体外阿帕替尼对N14069及N14042细胞具有抑制其增殖的作用,IC-50 分别为:239.4umol/l,442.1ummol/l。给药后:在第 96h,120h 时间点上,阿帕替尼对于N14042及N14069细胞生长抑制明显大于对照组,差别具有统计学意义(P<0.01)。细胞周期实验结果显示:在N14069细胞中G1期细胞百分比由61.66%增加至68.32%(P<0.01);N14042细胞中G1期细胞百分比由76.45%增加至85.48%(P<0.01)。然而在N14069细胞中S期细胞百分比由15.22%下降至8.45%(P<0.01);N14042细胞中S期细胞百分比由8.51%下降至5.4%(P<0.01)。侵袭实验结果显示:与对照组N14069及N14042细胞相比,给药组N14069及N14042细胞侵袭穿过侵袭小室底膜的数量显著减少(P<0.01)。2.全转录组芯片生物信息分析法显示阿帕替尼下调了N14069细胞的380个基因,下调了 14042细胞的649个基因,这些基因中重叠的基因有155个。等重同位素多标签相对定量蛋白质组学显示给药组与对照组相比下调的蛋白有559个。选择基因芯片下调最高10个基因,与蛋白质组学下调的蛋白的上游基因联合,发现共有9个基因重复,其中THBS1由于下调最高,推测THBS1基因为阿帕替尼作用于胶质瘤细胞的驱动基因。3.Western-blot结果显示:给药组N14069细胞及N14042细胞中THBS1蛋白水平的表达显著低于对照组N14069及N14042细胞(P<0.01)。4.RT-PCR显示在N14069细胞中的表达丰度,对照组与给药组比值为1.004:0.187(P<0.01),在 N14042 细胞中为 1.003:0.060(P<0.01)。5.将载有shRNA-THBS1基因片段的3种慢病毒转染至N14069和N14042细胞中,通过RT-PCR和荧光显微镜检测发现转染第3种病毒后的胶质瘤细胞中THBS1的表达水平较对照组增高,并且在N14069细胞中THBS1基因敲减效率达到60.2%(P<0.05)。在N14042细胞中THBS1基因敲减效率达到48.2%(P<0.05)。6.THBS1基因下调后,MTT实验显示:干扰组细胞增殖下降(P<0.01)。细胞周期实验结果显示:N14069细胞中G1期细胞百分比由51.28%增加至54.25%(P<0.01),S期细胞百分比由14.11%下降至13.29%(P<0.01);N14042细胞中G1期细胞百分比由58.68%增加至62.95%(P<0.01),S期细胞百分比由20.5%下降至17.69%(P<0.01)。侵袭实验结果显示:与对照组N14069及N14042细胞相比,干扰组N14069及N14042细胞侵袭穿过侵袭小室底膜的数量显著减少(P<0.01)。7.THBS1基因过表达后,MTT实验显示:给予阿帕替尼培养后,过表达组细胞逆转阿帕替尼抑制作用,较阴性对照组增殖上升(P<0.01)。细胞周期实验结果显示:给予阿帕替尼培养后,过表达组逆转阿帕替尼药物作用,与阴性对照组相比,N14042细胞中G1期细胞百分比由62.09%增加至64.86%(P<0.01),S期细胞百分比由11.09%下降至9.55%(P<0.01);G2/M期细胞百分比由26.82%下降至25.58%(P<0.05)。侵袭实验结果显示:给予阿帕替尼培养后,与阴性对照组N14042细胞相比,过表达组N14042细胞侵袭穿过侵袭小室底膜的数量未见统计学差异(P>0.05)。结论(1)阿帕替尼具有抑制人胶质瘤细胞N14069和N14042的增殖、侵袭,阻滞细胞周期的进展等作用。(2)给药组和对照组的全转录组芯片和蛋白组学芯片对比研究提示,阿帕替尼可能通过下调THBS1基因影响了 N14069细胞及N14042细胞的增殖能力。通过Western-blot和RT-PCR验证,在给药组中明显下调THBS1基因的蛋白和mRNA表达。(3)通过THBS1-shRNA干扰N14042及N14069细胞,使其THBS1表达下调后,两株胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力均受到明显抑制。(4)THBS1过表达后,具有逆转阿帕替尼对胶质瘤细胞的作用,N14042细胞的增殖能力增强,影响细胞周期。但THBS1过表达后,未见明显逆转阿帕替尼药物作用,N14042细胞的侵袭能力未见差异。(5)阿帕替尼通过调控THBS1基因抑制胶质瘤细胞的体外增殖、细胞周期,进而影响了胶质瘤的生长。