PTH1-34通过增强自噬改善去卵巢大鼠骨质疏松及促进成骨细胞增殖和分化研究

来源 :福建医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:a595165933
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第一章PTH 1-34治疗去卵巢大鼠骨质疏松过程中自噬水平变化目的:探讨PTH 1-34治疗卵巢切除后大鼠骨质疏松过程中自噬水平变化情况。方法:通过去卵巢建立骨质疏松大鼠模型,将24只3月龄SD大鼠随机分为假手术组(sham),去卵巢组(OVX),予PTH 1-34治疗去卵巢大鼠(OVX+PTH)。8周后,通过DEXA和micro-CT骨密度和骨微细结构,并用酶联免疫试剂盒检测血中骨代谢指标Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)及Ⅰ型胶原C-末端交联肽(CTX)、雌激素(E2)、及抗氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平,Western blot检测自噬特异性基因Beclin 1、LC3-Ⅱ及p62的表达。结果:卵巢切除后骨质疏松大鼠骨代谢指标PINP及E2、SOD、CAT降低,CTX增加,自噬相关基因Beclin 1、LC3-Ⅱ及p62蛋白在OVX组表达增加。PTH 1-34治疗OVX大鼠,可增加骨密度和改善骨微细结构,PINP及SOD、CAT增加,E2不变,CTX降低,自噬相关蛋白表达进一步增加。结论:绝经后大鼠骨质疏大鼠自噬水平增加,PTH 1-34治疗可增加骨密度、改善骨微细结构,其作用可能通过改善骨组织自噬水平有关,自噬水平改善可能与抗氧化能力提高有关。第二章PTH 1-34通过自噬促进成骨细胞增殖和分化及抑制凋亡过程的研究目的:研究PTH 1-34通过自噬促进成骨细胞增殖和分化及抑制凋亡的过程。方法:MC3T3-E1大鼠胚胎成骨细胞前体细胞培养,分为血清组、血清+PTH组、无血清组、无血清组+PTH。筛选出PTH 1-34的体外最佳使用浓度后,将MC3T3-E1大鼠胚胎成骨细胞前体细胞分为Control组(不做处理)、3-MA组(3-MA干预组)、PTH组(PTH 1-34干预组)、3-MA+PTH组。透射电镜观察细胞自噬小体形态,免疫荧光检测凋亡的发生。Western blot检测自噬相关蛋白B ecl-1、p62、ATG5、LC3-Ⅱ、cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP的表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blot和qRT-PCR和检测成骨细胞增殖分化相关蛋白Runx2?OCN?COL-1、BMP-2、Osterix表达水平。结果:PTH促进成骨细胞增殖及成骨细胞合成代谢相关蛋白的表达,同时自噬相关蛋白表达增加,自噬溶酶体形成增加;细胞凋亡减少;Western blot证实cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP蛋白降低;单独自噬抑制剂(3-MA)对骨合成代谢无明显影响,但可显著改变PTH 1-34作用下的细胞内合成代谢相关蛋白的改变,同时部分抑制细胞增殖及分化。结论:PTH 1-34除了抑制凋亡,还通过自噬促进成骨细胞增殖、分化,增加骨代谢合成相关指标。第三章Beclin 1基因对MC3T3-E1成骨细胞增殖?分化和凋亡的影响目的:研究Beclin 1基因对MC3T3-E1成骨细胞增殖?分化和凋亡的影响。方法:应用siRNA技术干扰Beclin 1基因载体,建立si RNA干扰Beclin 1的细胞系;观察在PTH 1-34干预下,采用CCK-8检测成骨细胞增殖率;流式检测Beclin 1基因干扰对细胞周期转化的影响;当成骨诱导分化48hrs,采用Western blot检测成骨分化相关Runx2?OCN?COL-1蛋白的表达;同时,采用流式细胞AnnexinV-FITC/PI染色法检测Beclin 1基因对成骨细胞凋亡的影响。结果:构建成功稳定Beclin 1干扰的MC3T3-E1细胞系;Beclin 1基因干扰可导致细胞增殖受抑制;Beclin 1基因干扰导致细胞周期停滞于G1期;MC3T3-E1细胞诱导分化48hrs,Western blot检测结果示Beclin 1基因干扰抑制Runx2?OCN?COL-1蛋白和基因的表达。PTH 1-34处理,上述改变无明显变化。结论:自噬基因Beclin 1干扰致使成骨细胞增殖和分化受抑制,同时Beclin 1基因干扰导致PTH 1-34作用明显减弱。提示,Beclin 1可能是PTH 1-34抗骨质疏松治疗的有效靶点。
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