背景：脑胶质瘤是最常见颅内的恶性肿瘤之一,约占全部脑肿瘤的45-55%。根据WHO的分期标准,将其分为(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)4个等级,Ⅰ、Ⅱ级恶性度较低,而Ⅲ、Ⅳ级恶性度较高。目前,脑胶质瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗和综合治疗等。尽管近年来涌现出许多新的治疗手段,但由于胶质瘤呈浸润性生长,与周围组织无明显分界且易于复发,患者的预后仍未得到明显改善。经过综合治疗后,对于低级别脑胶质瘤(WHOⅠ-Ⅱ级)患者而言,中位生存期在8-10年之间；对于间变胶质瘤(WHOⅢ级)患者而言,中位生存期在3-4年之间；对于脑胶质瘤(WHOⅣ级)患者而言,中位生存期在14.6-17个月之间。单独使用放疗,仅有不足1%的患者可以存活5年。因此寻找新的靶点和治疗方法,提高脑胶质瘤治疗的效率,具有非常重要的意义。自噬(autophagy),是真核生物细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。在提供能量、清除异常的细胞器、阻止染色体异常和维持基因组稳定性中起着重要作用。近年来的研究发现,肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点,对营养和能量等的需求比正常细胞更高,但肿瘤微环境往往不能如意,如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断,肿瘤细胞通过诱导自噬获得生存优势,使其能在恶劣的微环境下得以生存。已有文献报道,当化疗、放疗后,肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分,而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质,并提供应底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件,因此,一定程度的自噬可以增强放化疗的疗效,另外增强自噬也会直接导致肿瘤细胞自噬性死亡。自噬还被认为是Ⅱ型程序性细胞死亡,另外抗肿瘤药物直接或间接诱导细胞死亡有关,通过调控自噬信号途径来治疗各种肿瘤,已逐渐被更多的人接受,并有望成为治疗的新手段,从而自噬作为一种新的治疗手段越来越受科研工作者的关注。ZD6474 (ZactimaTM Vandetanib)是一种苯胺基喹唑林化合物,为强效的口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI),可同时作用于肿瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)和RET酪氨酸激酶。其化学名为(N-4-溴-2-氟苯基)-6甲氧基-7(1-甲基哌啶-4)甲氧基喹唑林-4-氨。由Astrazeneca制药公司研发,目前处于Ⅲ期临床试验阶段。2006年2月,被FDA批准用于治疗滤泡型、髓质型、未分化型以及局部进展或转移性的乳头状甲状腺癌。其药理作用机制可能有：通过同时作用于肿瘤细胞EGFR、VEGFR和RET等酪氨酸激酶,抑制酪氨酸激酶磷酸化,阻断肿瘤细胞信号的转导；抑制肿瘤细胞的损伤修复、使细胞分裂阻滞在G1期、诱导和维持细胞凋亡、抗新生血管形成等。目的本课题旨在研究酪氨酸激酶抑制剂ZD6474诱导的脑胶质细胞自噬作用及其相关的分子机理,以揭示自噬在ZD6474诱导的脑胶质瘤细胞死亡中所起的作用,为寻找靶向自噬分子的抗肿瘤药物提供理论依据。第一章 小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474诱导脑胶质瘤细胞自噬一、方法1.脑胶质瘤细胞株U87MG和U251细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,定期传代,选择处于对数生长期细胞作为实验用；2.CCK8法检测药物对人脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用；3.细胞分为对照组和药物组,电镜下观察ZD6474作用后U87MG细胞和U251细胞自噬情况；4.脑胶质瘤细胞转染GFP-LC3后,激光共聚焦观察ZD6474处理后U87MG和U251细胞自噬情况；5.采取上述分组,用免疫印迹法检测ZD6474处理后,脑胶质瘤U87MG和U251细胞LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达情况。二、内容和过程1.用CCK8法检测药物对人脑胶质瘤细胞U87MG和U251增殖的抑制作用,单药组分别加入ZD6474设0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μmol/L7个浓度,作用72h后检测,对照组加入等容积的稀释液；2.人脑胶质瘤细胞U87MG和U251,实验分为单药组分别加入3种不同浓度ZD6474 2μmol/L、4μmol/L、8pmol/L,对照组加入等容积的稀释液；人脑胶质瘤细胞U87MG和U251单药组加ZD6474 4μmol/L,分别作用6、12、24h,对照组同样处理时间但不加药,Western blot检测细胞自噬的相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表达情况；3.人脑胶质瘤细胞U87MG和U251单药组加ZD6474 4μmol/L,对照组不加药,24h后用电镜观察细胞自噬小体或自噬溶酶体；4.构建自噬标记物GFP-LC3质粒,并转染细胞,经不同浓度处理48h后行激光共聚焦显微镜观察细胞自噬情况。三种不同的方法来检测药物作用细胞后自噬情况,多种检测方法的联合使用保证了实验结果的可靠性。三、统计-方法所有计量数据均以均值±标准差(mean±SD)表示,对于两因素多水平的计量数据,采用析因设计的方差分析。对于单独效应的分析,当数据满足正态性和方差齐性时,采用两独立样本t检验或ANOVA,不满足则采用校正的t’检验和Welch检验；基于ANOVA分析后的多重比较,则采用Bonferroni方法,组间两两比较方差齐性采用LSD法。使用SPSS13.0统计软件和Graphpad prism软件进行数据分析,检验水准α取0.05,p<0.05,认为差异具有统计学意义。四、结果1.小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474在体外能抑制U87MG和U251细胞的增殖,呈现剂量-效应关系；2.随着ZD6474浓度的增加和作用时间的延长,自噬发生的标志性蛋白而LC3 Ⅱ表达显著上调,提示LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化不断增强；3.透射电镜观察对照组细胞内部超微结构、线粒体、内质网、核染色质、细胞核、细胞膜和高尔基复合体清晰可见,未见细胞自噬溶酶体。ZD6474处理脑胶质瘤细胞U87MG和U251后可看到细胞中自噬体及自噬溶酶体,同时胞质内线粒体发生肿胀；4.激光共聚焦观察转染GFP-LC3后的脑胶质瘤U87MG细胞和U251细胞,镜下可见点状聚集的绿色荧光斑阳性的细胞,提示ZD6474能诱导脑胶质瘤细胞发生自噬。五、结论1.小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474可抑制脑胶质瘤细胞U87MG和U251细胞的增殖活性；2.小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474能诱导脑胶质瘤细胞U87MG和U251的白噬；自噬发生呈明显的浓度、时间依赖性,随着处理药物浓度的增大和时间延长,自噬程度增加。第二章小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474诱导脑胶质瘤细胞U87MG和U251细胞自噬的机制研究一、方法用免疫印迹法检测自噬相关信号通路蛋白(AKT、p-AKT、S6、4EBP1),自噬相关蛋白(ATG7、Beclinl)的表达变化,以验证药物作用脑胶质瘤细胞诱导的自噬是否通PI3K/AKT/mTOR通路。二、内容和过程我们上一步的研究结果已提示小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474诱导脑胶质瘤细胞U87MG和U251细胞的自噬的形成。有报道发现细胞自噬的产生与mTOR通路有关系。为研究小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474诱导脑胶质瘤细胞U87MG和U251细胞的自噬是否通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路?我们进一步探讨小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474诱导脑胶质瘤细胞U87MG和U251细胞的自噬的机制。1.人脑胶质瘤细胞U87MG和U251单药组加ZD6474 4μmol/L,分别作用0、6、12小时,通过免疫印迹法检测mTORC1下游蛋白S6、p-S6、4EBP1、 p-4EBP1以及AKT、p-AKT,自噬相关蛋白ATG7和Beclinl的改变；2.为了进一步证实与mTOR通路关系,我们用insulin作用细胞,激活mTOR信号通路。ZD6474 4μmol/L作用脑胶质瘤细胞,检测细胞内p-S6、p-AKT、LC3 Ⅰ/Ⅱ蛋白的变化。三、统计计法所有计量数据均以均值±标准差(mean±SD)表示,对于两因素多水平的计量数据,采用析因设计的方差分析。对于单独效应的分析,当数据满足正态性和方差齐性时,采用两独立样本t检验或ANOVA,不满足则采用校正的t’检验和Welch检验；基于ANOVA分析后的多重比较,则采用Bonferroni方法。使用SPSS13.0统计软件和Graphpad prism软件进行数据分析,检验水准a取0.05,p<0.05,认为差异具有统计学意义。四、结果1.免疫印迹法检测表明药物处理人脑胶质瘤U87MG和U251细胞72h后,与对照组相比,实验组PI3K/AKT/mTOR通路相关信号分子AKT及S6、4EBP1蛋白的磷酸化显著下降,自噬相关蛋白ATG7和Beclinl表达未见显著改变；2.用mTOR通路激活剂insulin作用U251细胞后,S6和AKT磷酸化水平显著增高,提示mTOR通路被激活,然后应用ZD6474处理细胞,S6和AKT磷酸化水平显著下降,insulin单独作用细胞后自噬相关蛋白LC3 Ⅱ表达显著性下降,与ZD6474单独作用细胞相比较insulin作用U251细胞后,然后ZD6474诱导的LC3 Ⅱ表达显著性下调,提示ZD6474是通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性诱导细胞自噬。五、结论小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474诱导脑胶质瘤细胞U87MG和U251细胞的自噬可能受PI3K/AKT/mTOR信号通路的调节。第三章抑制小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474引起的脑胶质瘤U87MG和U251细胞自噬可促进细胞凋亡一、方法1.用siRNA Atg7沉默U87MG和U251细胞自噬基因,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ变化；2.用CCK8检测SiRNAAtg7沉默后ZD6474对U87MG和U251细胞生长的抑制作用；3.自噬抑制剂氯喹和ZD6474 4μmol/L联合作用于U87MG和U251细胞后,用Annexin V试剂盒检测细胞凋亡；4.用Caspase试剂盒活性检测U87MG和U251细胞Caspase-9和Caspase-3的改变。二、内容和过程1.首先,我们用siRNA Atg7沉默U87MG和U251细胞自噬基因,下调其蛋白表达水平,检测自噬蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ的水平,以进一步研究siRNA沉默Atg7自噬基因的蛋白后细胞凋亡；2.随后用CCK8检测U87MG和U251细胞,细胞分为四组,对照组、SiRNAAtg7沉默组、ZD6474单药处理组和SiRNA Atg7沉默+ZD6474组,检测U87MG和U251细胞增殖；3.为了进一步证实抑制自噬增加细胞凋亡,我们将U87MG和U251细胞分为四组：对照组、氯喹25μmol/L单药组、ZD6474 4μmol/L组和氯喹25mol/L联合ZD6474 4μmol/L组,用Annexin V试剂盒检测细胞凋亡；4.进一步检测细胞自噬抑制是通过那条凋亡通路实现的,我们用Caspase试剂盒活性检测自噬抑制剂氯喹25μmol/L处理组、ZD6474单药4μmol/L、 ZD6474(4μmol/L×24小时)与氯喹(25μmol/L×24小时)联合,对照组不加药,处理U87MG和U251细胞Caspase-9和Caspase-3的改变。三、统计方法所有计量数据均以均值±标准差(mean±SD)表示,对于两因素多水平的计量数据,采用析因设计的方差分析。对于单独效应的分析,当数据满足正态性和方差齐性时,采用两独立样本t检验或ANOVA,不满足则采用校正的t检验和Welch检验；基于ANOVA分析后的多重比较,则采用Bonferroni方法或组间两两比较方差齐性采用LSD法。使用SPSS13.0统计软件和Graphpad prism软件进行数据分析,检验水准α取0.05,p<0.05,认为差异具有统计学意义。四、结果1.应用siRNA下调U87MG和U251细胞Atg7表达后,与siRNA对照组相比,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达显著下调,提示细胞自噬受抑制。然后应用ZD6474处理siRNA-Atg7组和siRNA对照组细胞,结果显示siRNA-Atg7组细胞LC3-Ⅱ表达上调水平显著性低于siRNA对照组细胞LC3-Ⅱ表达上调水平,提示Atg7基因沉默可抑制ZD6474导致的U251细胞自噬。2.同上法应用ZD6474处理siRNA-Atg7组和siRNA对照组细胞,采用CCK8法检测细胞增殖活性,结果示：siRNA-Atg7组细胞增殖活性显著性低于siRNA对照组细胞,提示ATG7基因沉默后可增强ZD6474对细胞增殖抑制作用。3.同上法应用ZD6474处理siRNA-Atg7组和siRNA对照组细胞,采用Annexin V检测细胞凋亡率,结果示：siRNA-Atg7组细胞凋亡率显著性高于siRNA对照组细胞,提示Atg7基因沉默后可增强ZD6474诱导的细胞凋亡。4.ZD6474单独或联合细胞自噬抑制剂氯喹作用于U87MG和U251,结果发现,ZD6474联合氯喹后,细胞凋亡率显著性高于单用ZD6474,且凋亡相关分子Caspase-9和Caspase-3表达显著增高,提示氯喹抑制细胞自噬后可增强ZD6474诱导细胞的凋亡。五、结论抑制ZD6474诱导的脑胶质瘤细胞U87和U251细胞自噬作用,可促进细胞凋亡。