抗菌肽O3TR,C12O3TR和Jelleine-Ⅰ对柑橘Penicillium digitatum的控制效果及机制研究

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由指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病是柑橘果实在采后贮藏运输过程中严重且常见的一种侵染性病害,给柑橘产业造成了巨大的经济损失。现阶段,控制柑橘果实采后侵染性病害的主要方式是使用化学杀菌剂,但由于长期使用化学杀菌剂,已使人体健康和环境受到了威胁,且提高了病原菌的耐药性,因此化学杀菌剂的使用受到了越来越多的限制。目前,寻找对人体健康和环境安全无害的物质或方式来代替或减少化学杀菌剂的使用,已成为果蔬采后领域的研究热点。近年来,抗菌肽因其高效的抑菌性和不易产生耐药性等优点,在医药业、农业、食品工业及畜牧业开始得到越来越多的关注,然而抗菌肽在控制柑橘果实采后病害方面的研究还较少。本文以抗菌肽O3TR,C12O3TR和Jelleine-I为实验材料,在离体和活体条件下探究三种抗菌肽对柑橘P.digitatum的控制效果。为探究三种抗菌肽的商业应用价值,实验对三种抗菌肽的抑菌作用稳定性进行了测试。此外,为探究三种抗菌肽的作用机理,实验通过荧光显微镜观察,以及测定胞外电导率和核酸物质释放量,探究了三种抗菌肽对P.digitatum细胞膜完整性的影响。最后借助RNA-Seq技术,分析P.digitatum经C12O3TR处理后的机体应答。主要研究结果如下:(1)抗菌肽O3TR,C12O3TR和Jelleine-I均能有效抑制P.digitatum的生长,对其孢子和菌丝有较强致死作用。抗菌肽O3TR,C12O3TR和Jelleine-I的最小抑菌浓度(MIC)分别为12.5、6.25和6.25?mol L-1,最小杀菌浓度(MFC)分别为50、12.5和12.5?mol L-1,当O3TR,C12O3TR和Jelleine-I的浓度分别为50、6.25和25?mol L-1时,P.digitatum菌丝存活率低于50%。在果实实验中,抗菌肽O3TR,C12O3TR和Jelleine-I在四种接种方式(抗菌肽与孢子悬浮液混合0 h或16 h后接种、先加入抗菌肽溶液后接种孢子悬浮液、先接种孢子悬浮液后加入抗菌肽溶液)下均能有效控制柑橘果实采后绿霉病的发生。O3TR,C12O3TR和Jelleine-I对P.digitatum的作用具有热稳定性和耐酸碱性,且不受K+的影响,但易因Ca2+而出现衰减。O3TR和Jelleine-I的抑菌活性在高浓度Na+中,出现减弱,但C12O3TR的抑菌活性不发生改变。O3TR和Jelleine-I的抑菌活性易受蛋白酶K、胰蛋白酶和?-胰凝乳蛋白酶的影响,仅在低浓度的蛋白酶中保持原有的抑菌活性。但C12O3TR的抑菌活性在蛋白酶K和胰蛋白酶中不发生改变,仅在高浓度?-胰凝乳蛋白酶(1 mg m L-1)处理下出现衰减。(2)P.digitatum菌丝体和孢子经抗菌肽O3TR,C12O3TR和Jelleine-I处理后,其细胞膜的通透性增加,荧光染料SG和PI进入细胞内与胞内核酸物质结合,使部分菌丝体和孢子分别呈现绿色和红色荧光,并引起胞外电导率和胞内核酸物质的泄漏量随着抗菌肽浓度的增加和处理时间的延长而增大。(3)利用RNA-Seq技术,从P.digitatum经抗菌肽C12O3TR处理2 h和12 h后的样本中,分别筛选得到2562和667个基因差异表达,并通过荧光定量PCR实验验证了RNA-Seq的结果具有可靠性。2 h和12 h差异基因代谢途径分析结果均表明,C12O3TR会影响P.digitatum体内与能量供应、细胞壁上的多糖和几丁质合成代谢、细胞膜上的类脂和甾醇类等物质合成代谢相关的代谢途径,并干扰P.digitatum细胞内遗传物质的转录、翻译以及蛋白质的修饰、转运过程。综上,本文从抗菌肽O3TR,C12O3TR和Jelleine-I对P.digitatum的离体抑菌效果、对柑橘果实采后绿霉病的控制效果、对P.digitatum作用的稳定性、对P.digitatum细胞膜完整性的影响以及利用RNA-Seq技术分析C12O3TR对P.digitatum可能存在的作用机制这几方面对三种抗菌肽进行了抑菌效果和抑菌机制的研究,从而为控制柑橘果实采后绿霉病提供新的思路和和理论参考。
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