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MicroRNA(miRNA)是一类长度为21～23个核苷酸(nt)的高度保守的非编码单链小分子RNA,它们参与的基因表达调控过程涉及发育、衰老、死亡的时序控制、细胞凋亡、脂肪细胞分化、胰岛素分泌等。有报道称,microRNAs对成肌细胞不同阶段的增殖、分化、生长、发育起着很重要的调控作用。研究表明,受TGF-β1调节的miR-24推动C2C12细胞的分化;而增殖期的猪骨骼肌卫星细胞中,miR-24的表达量极高。
骨骼肌卫星细胞亦被称为肌肉干细胞,是位于肌细胞膜和基底膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。肌卫星细胞的增殖与分化程度对骨骼肌纤维数量起着决定性作用。体外培养的骨骼肌卫星细胞可应用于组织工程、基因治疗以及基因功能研究等多个方面。
为了明确猪骨骼肌卫星细胞中miR-24的功能及其作用的靶基因,本研究分析了不同生长阶段的长白和蓝塘猪背肌和背膘中miR-24的表达量,构建了miR-24超表达载体,并转染了原代猪骨骼肌卫星细胞,检测了肌细胞特异性基因的表达水平,分析miR-24对细胞增殖和分化的影响。另外,运用生物信息学的方法预测miR-24的靶基因,将预测的靶基因的3UTR序列克隆到pmirGLO载体上构建荧光素酶报告基因,与miR-24表达载体或对照质粒共转染293FT细胞以证实其靶点。所得结果如下:
1、分析不同生长阶段的长白和蓝塘猪种的背肌和背膘中miR-24中的表达,结果表明,在背最长肌中,2日龄蓝塘猪的miR-24的表达量显著高于长白猪,与其它生长阶段相比,长白猪和蓝塘猪的miR-24的表达水平在120日龄时最低;在背膘中,28日龄蓝塘猪的miR-24的表达水平显著高于长白猪;而在180日龄中,则是长白猪的miR-24的表达量显著高于蓝塘猪;长白猪和蓝塘猪的miR-24的表达量均在90日龄时最低。
2、与脂质体转染试剂LipofectamineTM LTX相比,非脂质体转染试剂FuGENE(R)HD很适于原代猪骨骼肌卫星细胞的转染。
3、采用非脂质体转染试剂介导表达载体和反义链进入猪骨骼肌卫星细胞,结果表明,超表达miR-24能够明显上调MyoD、MyoG、Myf5和CAV3的mRNA表达水平;抑制miR-24的表达对基因的mRNA表达水平作用不明显。
4、双萤光素酶报告基因结果表明,MyoG可能是miR-24的一个靶基因。