论文部分内容阅读
螺旋藻渣是工业上螺旋藻粉生产过程中沉积物,蛋白含量高,资源丰富。为充分利用螺旋藻副产物资源,减少废液排放,降低企业生产螺旋藻成本,本文拟以螺旋藻渣为原料,研究其发酵产物功能活性及优化工艺,以期为科学合理开发利用螺旋藻渣提供理论基础和技术支撑。对螺旋藻渣的基本营养组成、常量元素和重金属含量进行分析,评价不同菌种发酵螺旋藻渣的发酵产物功能活性。结果表明,螺旋藻渣蛋白质含量较高,氨基酸种类丰富,是微生物生长繁殖的良好基料。五种菌种发酵螺旋藻渣的发酵产物中,枯草芽孢杆菌YA215和地衣芽孢杆菌YA269发酵产物对DPPH和ABTS自由基有较强的清除能力,罗伊氏乳杆菌LR419发酵产物体外降血脂活性最为突出。与酵母菌NBRC10858和保加利亚乳杆菌YB177发酵产物相比,枯草芽孢杆菌YA215、地衣芽孢杆菌YA269和罗伊氏乳杆菌LR419等三种益生菌的螺旋藻渣发酵产物对食源性致病菌抑菌效果更好,且抑菌谱更为广泛。研究表明:枯草芽孢杆菌YA215发酵螺旋藻渣发酵液具有良好的开发潜力。以发酵上清液中性蛋白酶活、多肽含量及对金黄色葡萄球菌抑菌率为指标,通过单因素实验、Plackett-Burman实验和正交试验,优化枯草芽孢杆菌YA215发酵螺旋藻渣工艺条件。结果表明,发酵初始溶液中,螺旋藻渣添加量15 g/L、果糖添加量10 g/L、Na Cl添加量10 g/L、YA215接种量75 ml/L(发酵剂菌落含量为10~7-10~8CFU/m L)、p H 7.0,37℃摇床培养48 h(转速200 r/min),其发酵上清液中性蛋白酶活达到147.4 U/m L,多肽含量为16.8 mg/m L,对金黄色葡萄球菌抑菌率为64.6%,产生的抑菌圈直径大小为15.3 mm,抑菌性提高196%。研究表明:经优化后的螺旋藻渣的YA215发酵液与尼萨普林的抑菌性相当,且抑菌率与多肽含量正相关。采用Sephadex LH-20和半制备型HPLC对螺旋藻渣发酵产物中抗菌物质进行分离纯化。结果显示,经两步纯化后的抗菌组分BAS-F1-P6是螺旋藻渣发酵产物中的主要抗菌物质,BAS-F1-P6在p H 6-9、55℃及以下均保持抑菌活性稳定,且对大多数蛋白酶不敏感,对细菌(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)和真菌(如黄曲霉)有良好的拮抗作用。利用MALDI-TOF-MS从BAS-F1-P6中共分析鉴定出Iturins和SP-AP-1两类抗菌肽。其中,SP-AP-1肽同源物为新型抗菌肽,SP-AP-1肽氨基酸序列为ATHDNCCLRQS,分子量1422.60 Da。研究表明:螺旋藻渣的YA215发酵液的抗菌性来源于SP-AP-1肽和Iturin A,其中SP-AP-1为一种首次报道的抗菌肽。对螺旋藻渣发酵液中分离出的抗菌肽SP-AP-1和Iturin A对金黄色葡萄球菌的抑菌机理进一步研究。结果表明:抗菌肽SP-AP-1和Iturin A均能引起金黄色葡萄球菌细胞膜通透性增加,导致胞内钾离子和蛋白质泄漏量及细胞膜的疏水性随之增加,但抗菌肽SP-AP-1的抑菌效果更为显著(P<0.05);同时,两种抗菌肽均能抑制菌体蛋白合成,尤其对分子质量为17、20、25～35 k Da之间的蛋白最为明显;虽然两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌基因组DNA没有明显阻滞作用,但增大抗菌肽浓度,SP-AP-1可使基因组DNA条带变暗,与溴化乙锭竞争性结合DNA,从而影响蛋白质的表达。研究结论:螺旋藻渣经枯草芽孢杆菌YA215发酵后,产生一种新型抗菌肽SP-AP-1,该肽通过对致病菌的细胞膜通透性、及菌体蛋白表达等方式抑制致病菌的增殖。