论文部分内容阅读
目的:探讨miR-129-5p通过Atg14介导的自噬抑制在小鼠真菌性角膜炎中的作用及机制。方法:1、采用生物信息学软件Target Scan(http://www.targetscan.org/)预测分析miR-129-5p作用的靶基因,筛选Atg14为miR-129-5p的目标基因,通过荧光素酶(Luciferase)报告基因检测技术及小鼠真菌性角膜炎模型中两次进行目标基因验证。2、体外培养小鼠角膜基质细胞并进行实验分组:正常未感染组;正常感染组(control组);抑制自噬组(3-MA组);激活自噬组(Rapa组);miR-129-5p抑制剂组(antagomir组);miR-129-5p模拟物组(agomir组);miR-129-5p阴性对照组(NTC组)。真菌孢子感染小鼠角膜基质细胞(感染复数=5)后在0、3、6、12、24h各时间点采用RT-PCR实验技术检测miR-129-5p表达差异;WesternBlot检测各组Atg14、Beclin1、LC3B‖蛋白表达差异;激光共聚焦显微镜观察各组角膜基质细胞Atg14、Beclin1、LC3B蛋白荧光信号强度差异;细胞LC3B蛋白与自噬溶酶体共定位观察检测自噬流在各组中的差异;细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力差异;CCK-8检测各组细胞活力差异。3、动物实验及分组:实验选用6-8周龄BALB/C雄性小鼠,随机分成7组并给予结膜下给药方式:正常未感染;正常感染组(control组,n=3);抑制自噬组(3-MA组,n=3);激活自噬组(Rapa组,n=3);miR-129-5p antagomir组(n=3);miR-129-5p agomir组(n=3);miR-129-5p NC组(NTC组,n=3)。给药1h后用改良表层镜面法成功建立茄病镰刀菌性角膜炎模型,建立模型后1、3、5、7、10天五个时间点观察、记录小鼠角膜感染真菌后的角膜裂隙灯下病变特点;对角膜混浊面积、密度、和病变表面的规则性进行临床评分;角膜载菌量实验检测各组真菌清除情况差异;RT-PCR检测真菌性角膜炎病变进展过程中miR-129-5p表达情况;Western-Blot检测各组Atg14、Beclin1、LC3B‖蛋白表达情况;组织冰冻切片免疫荧光染色观察各组角膜中Atg14、Beclin1、LC3B蛋白荧光信号强度差异;ELISA实验检测IL-6和IL-1β在感染第1、3、5、7天各时间点各组的表达水平。结果:1、荧光素酶报告基因结果显示:miR-129-5p对Atg14的报告荧光有显著下调作用,当靶位点突变后,报告荧光有所恢复,miR-129-5p确实通过与Atg14 3’UTR结合直接调控Atg14的表达,表明Atg14是miR-129-5p的靶基因;同时采用westernblot进行蛋白表达水平的检测,结果表明:miR-129-5p antagomir组与antagomir NTC组对比,miR-129-5p显著促进Atg14蛋白表达(P<0.05);miR-129-5p agomir组与agomir NTC组对比,显著抑制Atg14蛋白表达(P<0.05),以上结果显示mi R-129-5p对Atg14蛋白具有负性调节作用。2、小鼠角膜基质细胞模型实验的RT-PCR检测结果显示:感染真菌孢子后第6h角膜基质细胞中miR-129-5p表达量显著升高;感染真菌孢子后6h后的WesternBlot实验结果显示:与正常感染组及NTC组相比,基质细胞Atg14、Beclin1、LC3B‖蛋白表达量在miR-129-5p antagomir组、Rapa组表达均显著升高,3-MA组表达显著降低(P均<0.05);细胞激光共聚焦结果发现与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5p antagomir组与Rapa组中的Atg14、Beclin1、LC3B蛋白荧光信号明显增强而miR-129-5p agomir组、3-MA组Atg14、Beclin1、LC3B蛋白荧光信号强度明显减弱;LC3B蛋白与自噬溶酶体共定位结果提示与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5p antagomir组、Rapa组自噬流的二者共定位荧光信号强度显著强于miR-129-5p agomir组和3-MA组。感染真菌孢子12h后的细胞划痕实验的统计结果显示,与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5p antagomir组、Rapa组细胞划痕后的迁移面积显著增大,而miR-129-5P agomir组、3-MA组明显减少;cck-8细胞活力检测实验结果表明:与正常感染组及NTC组相比miR-129-5p antagomir组、Rapa组细胞活力显著增高,而miR-129-5p agomir组、3-MA组细胞活力显著降低。3、动物模型实验研究结果:RT-PCR检测结果表明感染真菌第3天后角膜组织中miR-129-5p表达显著升高;角膜图像采集并裂隙灯下观察角膜炎症变化及其病变特点和临床评分显示,与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5p antagomir组、Rapa组的角膜炎症反应较轻,较少发生局部溃疡、坏死,角膜不易穿孔,病程明显缩短,角膜后期新生血管反应最轻;角膜载菌量结果显示:小鼠角膜真菌载量随着时间的推移呈现整体下降的趋势;与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5p antagomir组、Rapa组真菌清除速度最快,而miR-129-5p agomir组、3-MA组真菌清除速度最慢,(P<0.05);Western-Blot统计结果发现感染第3天角膜中Atg14、Beclin1、LC3B‖蛋白表达量与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5P antagomir组、Rapa组表达显著升高而3-MA组表达明显减少(P<0.05);组织冰冻切片病理染色结果显示:在角膜基质层中与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5P antagomir组、Rapa组中Atg14、beclin1、LC3B蛋白荧光信号明显增强而miR-129-5P agomir组、3-MA组Atg14、beclin1、LC3B蛋白荧光信号强度明显减弱;ELISA细胞因子检测的实验结果显示,IL-6在感染早期表达显著升高,与正常感染组及NTC组相比,miR-129-5p antagomir组和Rapa组表达升高最为显著(P<0.05),IL-1β表达主要集中在中后期;与正常感染组及NTC组相比,在miR-129-5p agomir组和3-MA组升高最为显著(P<0.05)。结论:miR-129-5p直接调控靶基因Atg14;miR-129-5p通过靶向作用Atg14,调控自噬相关蛋白表达进而调控炎症反应,在小鼠真菌性角膜炎的发生发展中发挥重要作用。