氧浓度的变化对正常组织的功能和肿瘤的恶性进展都有直接的影响,大量临床数据显示实体瘤的缺氧程度与肿瘤的恶性程度及预后有直接的关系。研究表明,缺氧环境诱导肿瘤抑制因子p53的激活以及p53蛋白的积累,从而诱导细胞凋亡；而突变p53则可以促进细胞在缺氧条件下的存活。p53N236s(人类是p53N239S,以下简称p53S)是一个发生在p53 DNA结合域内的点突变,在本实验室的前期研究中发现,p53S不仅丧失了调控细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡的功能,还具有与Ras协同作用促进肿瘤形成的功能,我们还曾发现p53S小鼠和p53野生型小鼠对缺氧敏感性不同。因此,本研究以p53S突变为研究对象,探讨p53突变情况下细胞缺氧应激反应相关机制。我们以p53S的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast, MEF)为实验材料,使用去铁敏(deferoxamine, DFO)处理模拟缺氧微环境,研究p53S在缺氧应激反应中的功能。首先,我们使用DFO处理WT(p53野生型)、p53s/s(p53S纯合型)、p53S/+(p53S杂合型)这三种细胞。通过细胞形态观察,发现随着DFO处理时间的延长,WT细胞形态出现变圆、周边呈现透明、空泡状；而在p53S/s细胞中极少观察到这种现象,提示p53S细胞相比于WT细胞对缺氧应激更耐受。为了进一步解释p53S细胞对DFO处理耐受这一现象的机制,我们通过Western blot分析凋亡蛋白Caspase-3、PARP的表达情况,结果显示DFO可以诱导这三种细胞内凋亡蛋白Caspase-3、PARP的切割激活,并且p53S/S细胞出现Caspase-3、PARP的切割时间与WT相比较要晚；另外,流式细胞术分析细胞凋亡的结果也表明,p53s/s细胞出现凋亡的细胞比例要远小于WT细胞。说明,DFO模拟的缺氧微环境能够诱导WT、p53S/S、p53s/+细胞发生凋亡,但发生在p53S细胞中的凋亡应属于非p53依赖的凋亡途径,且与WT细胞相比较,p53s/s细胞发生的凋亡程度要小,诱导凋亡发生的时间要晚,提示p53S具有抗凋亡的作用。紧接着,我们对DFO处理条件下WT、P53S/S、P53S/+这三种细胞自噬发生的情况进行了检测,以研究对于缺氧应激反应p53S这一突变是否致使细胞有区别于WT应激缺氧的调控方式。首先,我们通过Western blot分析了LC-3蛋白的表达情况,然而在这三种细胞中都很明显检测到LC-3Ⅱ型带的表达,但随着DFO作用时间的延长,在p53s/s细胞中LC-3Ⅰ型带向LC-3Ⅱ型带转化明显,说明受缺氧应激的刺激作用p53s/s细胞中自噬增强。其次,我们还通过透射电镜检测了DFO模拟缺氧微环境下培养的细胞内是否出现自噬小体,透射电镜结果显示,与WT相比较p53S细胞中可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性,空泡样双层膜结构,并且双层膜结构内包裹着许多内含物,说明DFO模拟的缺氧环境诱导p53S细胞发生自噬。最后,我们使用单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法以及吖啶橙(AO)染色法检测不同DFO处理时间下细胞自噬程度,与WT相比较,p53s/s细胞随着DFO处理时间延长其着色程度明显要深,说明p53s/s细胞中发生的自噬程度要大于WT细胞。提示,面对DFO模拟的缺氧刺激,p53S细胞是通过调控细胞发生自噬来应对缺氧应激对细胞造成的损伤。另外,免疫荧光染色实验显示在p53s/s细胞中p53S蛋白发生非常明显的转位即由胞浆中转位至细胞核中,而细胞核中的p53可以增强自噬的发生,提示p53S蛋白参与自噬的调控。以上结果表明,p53S通过启动细胞自噬应答缺氧刺激,有区别于wtp53应激缺氧的调控机制。自噬与凋亡都是细胞的一种死亡方式,但两者之间又存在着千丝万缕的关系。根据其调控方式,二者之间的关系可以简单的将其归纳为：相互合作、相互对抗、相互促进。而我们的研究也发现,在DFO模拟的缺氧微环境下,细胞中既发生了凋亡也出现了自噬,为此我们对p53S细胞中的自噬与凋亡的关系进行了研究,研究过程中我们使用自噬抑制剂3-MA抑制细胞的自噬。采用3-MA抑制细胞自噬后,我们通过Western blot分析发现,抑制自噬后WT细胞中PARP、Caspase-3的切割水平降低,说明WT细胞凋亡水平也下降,也进一步说明对于缺氧刺激作用WT以诱导细胞发生凋亡为主,自噬为辅来调控缺氧应激反应；而在p53s/s细胞中,抑制自噬后,PARP、Caspase-3的切割水平反而上升,说明p53s/s细胞凋亡水平上升。随后的流式细胞仪检测的细胞凋亡的结果也显示,若抑制WT细胞的自噬后,细胞的凋亡水平也随之下降,然而若抑制p53s/s细胞中自噬后,凋亡水平反而增加。以上结果说明,在DFO模拟的缺氧应激条进行下,WT细胞中凋亡与自噬是相互促进的关系,p53s/s细胞中自噬与凋亡的关系是相互对抗的关系。提示,p53S有可能通过启动自噬抵抗细胞凋亡,从而获得抗凋亡的作用。随后,我们通过JC-10染色,流式细胞仪检测细胞的线粒体膜电位,发现p53S细胞经DFO处理后线粒体膜电位随处理的时间延长出现上升的趋势,而WT细胞的线粒体膜电位无明显变化：紧接着,我们对细胞进行DCFH-DA染色,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,发现经DFO处理时间的延长在这三种细胞内ROS水平并未出现明显增加的趋势；然而若抑制细胞自噬,p53S细胞内的ROS水平则出现急剧上升。提示,在缺氧应激的条件下p53S有可能通过启动线粒体自噬,清除受损的线粒体,以降低细胞内ROS水平,并通过清除受损的线粒体,增加细胞内完整的线粒体比例,从而造成细胞线粒体膜电位上升的假象。因此,面对缺氧应激反应,p53S可能通过启动线粒体自噬,清除受损的线粒体,减少细胞色素C的释放,从而抑制细胞凋亡。综上所述,我们在对DFO模拟的缺氧微环境下细胞发生的凋亡与自噬进行了研究,发现了面对缺氧应激p53N236S有区别于wtp53的应激调控机制,即p53N236S主要是通过诱导细胞启动自噬的来应答缺氧应激对细胞造成的损伤。同时,还发现p53N236S具有抗凋亡的作用。此外,还初步阐明p53N236S有可能通过诱导细胞发生线粒体自噬,清除受损的线粒体,减少细胞色素C的释放,从而使得p53N236S细胞具有抗凋亡的作用。对p53N236S突变细胞在缺氧微环境下应激机制变化的阐明,将进一步揭示突变p53细胞肿瘤化的潜在因素以及实体瘤中缺氧环境与p53突变之间的关联,为治疗p53突变肿瘤的临床基础研究提供理论支持。