类固醇脱氢酶（Hydroxysteroid dehydrogenase,HSD）是一种依赖于NAD（P）⁺/NAD（P）H的氧化还原酶,属于短链脱氢酶家族（Short-chain dehydrogenase/reductase,SDR）,在动植物中普遍存在且被证实为动物体内激素代谢的关键酶。恶臭假单胞菌SJTE-1（Pseudomonas putida SJTE-1）可高效降解雌二醇等雌激素物质,其基因组与蛋白组结果显示其胞内含有多个与潜在的雌激素代谢相关酶;但其酶学性质与调控因子尚不明确。本课题基于前期组学结果分析,拟对恶臭假单胞菌SJTE-1中的两个短链脱氢酶（HSD₁172和ACP reductase₄227）进行探究,通过体内和体外实验,解析其酶学性质,鉴定其转录调控因子,从而推进细菌降解雌二醇的分子机制研究。研究结果显示在雌激素为碳源的培养条件下,两个短链脱氢酶（HSD₁172和ACP reductase₄227）均可被有效诱导表达。蛋白序列比对和系统进化树结果显示两个酶均为17β-类固醇脱氢酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSD）,可催化底物的17位碳原子的酮基还原或羟基氧化。通过体外克隆表达和亲和纯化获得重组蛋白,蛋白大小分别是25.56Kd和26.91Kd。酶学实验结果显示,17β-HSD₁172和ACP reductase₄227都以NAD⁺作为辅因子催化雌激素D环C17位的脱氢反应,将17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）转化为雌酮（estrone,E1）;其最适反应温度为37℃,最适pH为pH 9.0;Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺可抑制该氧化反应,而Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺则有一定促进作用。17β-HSD₁172和ACP reductase₄227的K_m值分别是0.068 mM和0.071mM,其V_max分别为0.871 mM/s和0.347 mM/s。因此,17β-HSD₁172对雌二醇的转化效率更高,在其降解中起重要作用。在此基础上,本课题鉴定了两个可能参与调控17β-HSD₁172的转录因子蛋白OxyR_like和CrgA_like。蛋白序列比对与二级结构分析表明其与OxyR和CrgA家族的转录因子具有相似DNA结合结构,可通过识别保守序列T{N₁₁}A和GATA,结合基因上游启动子区,调控基因转录。克隆表达和亲和纯化获得两个重组蛋白后,体外凝胶阻滞实验结果显示OxyR_like和CrgA_like均可有效结合到hsd₁172的上游启动子区,其中OxyR_like与DNA的结合可被雌二醇有效解离,而CrgA_like的结合则不能;转录与表达结果分析显示,两者均可被雌二醇诱导转录,调控了17β-HSD₁172的表达。因此,本课题的结果将有助于推进细菌降解雌激素的分子机制与调控机理研究,为构建高效环境雌激素降解工程菌株提供理论基础。