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目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率有逐步上升的趋势,严重危害人民的健康。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）和相应的肿瘤坏死因子受体（tumornecrosis factor receptor,TNFR）结合,转导凋亡信号进入靶细胞,使靶细胞发生凋亡,是机体免疫系统清除肿瘤细胞的常见方式,而肿瘤细胞表达死亡因子的诱捕受体是肿瘤逃避机体免疫杀伤的机制之一。近年来新发现的TNFR超家族成员DcR3通过影响FasL、LIGHT和TL1A的促凋亡作用和免疫调节作用而抑制机体的抗肿瘤免疫,与肿瘤的发生、发展相关。研究表明HCC组织存在DcR3的过表达,影响HCC细胞的凋亡,且HCC患者DcR3的表达水平与肿瘤的TNM分期、浸润或转移有关。这些研究结果提示,若能抑制DcR3的表达则有助于阻抑肿瘤的发展与浸润转移。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）启动的一种序列特异性的转录后基因沉默机制,其介导子是21—25nt的小干扰RNA（short interfering RNA,siRNA）,由细胞内的dsRNA特异性核酸内切酶（dsRNA specific endonuclease,Dicer）酶切产生。由于siRNA具有特异性高、抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点,因此,RNAi技术目前已经被广泛应用于基因功能研究和基因治疗方面。本研究拟通过RNA干扰技术抑制HCC细胞系HepG2中DcR3的表达,检测DcR3干扰后HepG2细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性的改变,从而探讨DcR3在HCC发生发展与浸润转移中的作用。材料与方法1.应用RT-PCR方法检测人HCC细胞系HepG2、癌旁肝细胞系QSG-7701及正常肝细胞系HL-7702中DcR3的表达情况。2.设计并合成针对DcR3基因的特异性siRNA,采用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将siRNA转染至高表达DcR3的HCC细胞系HepG2,通过荧光显微镜下观察和应用流式细胞仪鉴定和检测转染效率。3.应用半定量RT-PCR方法筛选有效的靶序列,将筛选出的有效靶序列转染HepG2细胞,免疫细胞化学法检测其对HepG2细胞DcR3蛋白表达的影响。4.应用MTT法检测细胞增殖能力的改变。5.应用流式细胞仪测细胞周期的变化。6.应用流式细胞仪、DNA ladder方法检测细胞的凋亡情况。7.通过划痕实验检测细胞体外迁移能力的变化。结果1.人HCC细胞系HepG2细胞中DcR3 mRNA呈现高表达,而癌旁肝细胞系QSG-7701和正常肝细胞系HL-7702细胞中无DcR3 mRNA表达。2.LipofectamineTM2000能有效地将siRNA转染至细胞内,转染效率约为85%。3.各特异性DcR3-siRNA均有抑制DcR3 mRNA表达的作用,其中以siRNA4的作用更明显,干扰作用达62.9%,siRNA1、siRNA2、siRNA3的干扰作用分别为60.7%、32.1%、23.0%;转染siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4组的DcR3 mRNA表达与空白对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）;脂质体转染组及非特异性siRNA转染组对DcR3 mRNA的表达无影响,与空白对照组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。选择抑制作用最明显的siRNA4转染HepG2细胞作为特异性组进行后续实验。免疫细胞化学结果显示,空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组细胞DcR3蛋白呈阳性表达（++--+++）,特异性DcR3-siRNA4转染组细胞蛋白呈阴性或弱阳性表达（---+）,特异性DcR3-siRNA4转染组与前三组比较,差异有统计学意义（P＜0.01）。4.MTT实验:转染后24h、48h及96h特异性DcR3-siRNA4转染组细胞吸光度值明显低于空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组,差异有统计学意义（P＜0.001）。特异性DcR3-siRNA4转染组细胞的增殖抑制率在24h、48h及96h分别为20.71%、35.00%和34.04%。5.流式细胞仪测细胞周期:特异性DcR3-siRNA4转染组与空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组细胞相比,G1期细胞比例增多而G2/M期细胞比例减少,差异有统计学意义（P＜0.01）。6.流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示,特异性DcR3-siRNA4转染组细胞凋亡率为（22.97±2.10）%,明显高于空白对照组（1.17±0.32）%、脂质体转染组（1.44±0.43）%及非特异性siRNA转染组（1.22±0.40）%,差异有统计学意义（P＜0.001）。DNA ladder检测结果显示,特异性DcR3-siRNA4转染组DNA ladder阳性率为83.3%,明显高于空白对照组（0%）、脂质体转染组（0%）及非特异性siRNA转染组（0%）,差异有统计学意义（P＜0.01）。7.特异性DcR3-siRNA4转染组细胞相对迁移率在24h、48h及96h均低于空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组细胞,差异有统计学意义（P＜0.001）,而空白对照组、脂质体转染组及非特异性siRNA转染组每两组间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论特异性DcR3-siRNA能有效抑制肝癌细胞系HepG2的DcR3表达,使细胞周期阻滞于G1/S期,能有效地诱导细胞凋亡,并能抑制HepG2的增殖和细胞的迁移能力。