论文部分内容阅读
本文围绕大肠杆菌(Escherichia coli)核黄素生物合成的中下游途径，以E. coliK-12MG1655为出发菌株进行代谢工程改造。通过改造核黄素生物合成基因和嘌呤生物合成途径中的关键基因，逐步提高核黄素的生物合成。本研究首先对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和E. coli中的核黄素生物合成途径的相关基因进行过表达。同时构建了过表达B. subtilis和E. coli核黄素操纵子的质粒p20C-Bsrib和p20C-EC10，分别转化到野生型E. coli中，构建了菌株RF01B和RF01S。经摇瓶发酵，菌株RF01B生产了200.5mg/L核黄素，菌株RF01S生产了225.1mg/L核黄素。结果表明，过表达大肠杆菌自身的核黄素生物合成基因对核黄素的积累更有效。因此，选取RF01S菌株进行下一步地基因工程改造。在过量表达核黄素生物合成基因以后，核黄素生物合成的直接前体物--3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸(DHBP)和GTP的有效利用可能是核黄素生物合成的限制因素。因此，以RF01S作为出发菌株，通过提高ribB基因的表达和改造嘌呤生物合成途径来增加前体物的供给，进而提高核黄素的产量。首先，通过替换强启动子的方式过表达ribB基因来增加5-磷酸核酮糖到DHBP的通量。其次，依然通过替换强启动子的方式对ndk和gmk基因进行过表达来提高GTP的供给。然后，在purA基因中引入突变点来减少分支途径IMP到AMP的通量。最后，过表达突变的purF和prs基因来增加5-磷酸核酮糖到IMP途径的通量，同时减少一些终产物的反馈抑制。经摇瓶发酵，最终的菌株RF18S生产了387.6mg/L核黄素，其得率达到44.8mg/g葡萄糖。与RF01S菌株相比，分别提高了72.2%和55.6%。同时增加DHBP和GTP的供给能明显提高核黄素的产量。以上研究表明，可以通过理性代谢过程的方法来大幅度提高核黄素的产量，同时也为今后其它E. coli相关改造和应用工作提供了一些借鉴。